虫草素通过调控Akt与MAPK信号通路影响胃癌细胞生物学行为的机制研究

发布时间：2020-06-28 12:41

【摘要】：目的:探讨虫草素(Cordycepin,Cord)对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法:采用MTT法检测不同浓度虫草素对人正常胃黏膜上皮GES-1细胞和胃癌MGC-803细胞增殖活力的影响;平板克隆实验检测细胞集落形成能力;Hoechst 33342染色观察细胞中凋亡小体的形成;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;PI单染流式细胞术检测细胞周期;细胞划痕实验与Transwell小室迁移实验检测MGC-803细胞横向和纵向迁移能力;Western blot实验检测细胞凋亡、周期、EMT等相关标志物,及Akt信号通路与MAPK信号通路相关蛋白的表达。通过RT-PCR与Western blot验证GES-1与胃癌细胞株MGC-803、SG C-7901、HGC-27中C型凝集素样受体2(CLEC2)基因的表达水平及虫草素处理后MGC-803细胞中CLEC2基因的表达水平;通过siRNA转染技术沉默CLE C2基因,并通过Western blot验证转染效果;MTT法和细胞划痕实验观察CLE C2基因沉默对MGC-803细胞增殖及迁移能力的影响;Western blot实验检测C LEC2基因沉默对Akt信号通路蛋白的影响。结果:1.MTT实验结果显示,虫草素对GES-1细胞的抑制作用远弱于MGC-803细胞,且与对照组相比,不同浓度(25μM、25μM、100μM)的虫草素作用于MGC-803细胞24h、48h、72h,均可显著抑制细胞活力(P0.01);2.平板克隆实验结果显示,与对照组相比,用药组细胞的集落形成能力均显著下降(P0.01);3.Hoechst33342染色发现,与对照组相比,用药组细胞中凋亡小体随药物浓度的增加逐渐增多;4.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术结果显示,与对照组相比,50μM和100μM组细胞凋亡率显著增高(P0.05或P0.01);5.PI单染流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,用药组细胞出现G2/M期阻滞(P0.05或P0.01);6.细胞划痕实验与Transwell小室迁移实验结果显示,用药组细胞的横向与纵向迁移能力均显著降低(P0.01);7.Western blot实验结果显示,虫草素能够上调凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9、凋亡底物cleaved-PARP、上皮细胞标志物E-cadherin、MAPK信号通路中p-JNK与p-P38的表达水平(P0.05或P0.01);下调凋亡抑制蛋白survivin、细胞周期期相关蛋白CDK1、CyclinBl、CDC25C、间质细胞标志物Vimentin、Snail、Slug、基质金属蛋白酶家族成员MMP2和MMP9、Akt信号通路中p-Akt与p-4EBP1 的表达水平(P0.05 或P0.01);8.RT-PCR 与 Western blot 结果显示,MGC-803、SGC-7901、HGC-27细胞中CLEC2的mRNA与蛋白表达水平均明显低于GES-1细胞;9.RT-PCR与Western blot结果显示,CLEC2的mRNA与蛋白的表达水平随着虫草素药物浓度的增加而呈上升趋势;10.CLEC2基因沉默后减弱虫草素对胃癌细胞的抗增殖及抑制迁移的作用(P0.01);Western blot结果显示,CLEC2基因沉默后上调Akt蛋白的磷酸化水平(P0.05)。结论:1.虫草素抑制胃癌MGC-803细胞的增殖与迁移,其机制与下调Akt信号通路相关;2.虫草素阻滞MGC-803细胞于G2/M期,其机制与上调JNK和P38的磷酸化水平相关;3.虫草素通过上调CLEC2调控Akt信号通路抑制胃癌细胞增殖及迁移。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

图２．虫草素诱导ＭＧＣ－８０３细胞凋亡逡逑Ａ．虫草素处理ＭＧＣ－８０３细胞２４后用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色检测细胞凋亡（白色箭头所指），逡逑ｘ２００；邋Ｂ．虫草素处理ＭＧＣＣ－８０３细胞４８ｈ后用流式细胞术检测ＭＧＣ－８０３细胞凋亡率（＊：户逡逑＜０．０５，邋＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）邋；邋Ｃ．虫草素处理ＭＧＣ－８０３细胞２４ｈ后Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ实验检测细胞逡逑调亡相关蛋白邋Ｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ３、Ｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ９、Ｃｌｅａｖｅｄ－ＰＡＲＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋的表达水平（＊：逡逑尸＜０．０５；＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）邋？逡逑２９逡逑

图５．虫草素调控Ａｋｔ信号通路与ＭＡＰＫ信号通路逡逑八，８．虫草素处理＼１0（：－８０３细胞２４１１后认＾６１１＾１0１实验检测八１？信号通路中。－八１？、八１？、逡逑Ｐ－４ＥＢＰ１、４ＥＢＰ１邋和邋ＭＡＰＫ邋信号通路中邋ｐ－ＪＮＫ、ＪＮＫ、ｐ－Ｐ３８、Ｐ３８邋蛋白的表达（＊：尸＜０．０５，逡逑＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）。逡逑

【参考文献】

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本文编号：2733026