稳定沉默HPV16E6基因对宫颈癌SiHa细胞中E-cadherin高甲基化的影响

发布时间：2020-06-28 18:08

【摘要】：目的:宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤,不断威胁着女性的生命健康。人乳头瘤病毒16型(HPV16)被认为是宫颈癌最主要的外源性致病因素,其中E6癌基因在抑制细胞凋亡,干扰染色体稳定性,影响信号通路,以及免疫逃逸等方面起重要作用。E-钙黏蛋白(E-cadherin)是上皮细胞间粘附连接的重要分子,该基因表达沉默会引起上皮细胞表型和侵袭能力的改变。本课题组前期实验已证实,宫颈鳞癌组织中HPV16E6蛋白高表达与E-cadherin基因启动子区CpG岛高甲基化及E-cadherin蛋白表达下调有关。那么,HPV引起宫颈癌的发生发展是否通过E-cadherin基因启动子区甲基化的调节而致病仍有待研究。本实验通过构建HPV16E6基因shRNA慢病毒载体,感染宫颈癌SiHa细胞,筛选建立稳定细胞系,观察基因沉默后E-cadherin表达及基因启动子甲基化的情况,观察其细胞生物学功能。初步研究分析HPV16E6对E-cadherin基因高甲基化的作用机制,为宫颈癌的基因治疗寻找有效靶点。方法1、培养宫颈癌SiHa细胞系,构建HPV16E6基因shRNA慢病毒沉默载体质粒,转入感受态细胞获取阳性克隆,进行PCR扩增测序。将病毒载体共转染到293T细胞进行包装,测定病毒滴度,用嘌呤霉素筛选建立沉默稳转细胞系。2、设置shRNA E6沉默组、空载体组、空白对照组。RT-q PCR检测HPV16E6、E-cadherin mRNA表达情况,Western Blot检测HPV16E6基因沉默后蛋白表达情况,CCK-8法及划痕实验检测SiHa细胞增殖迁移能力,甲基化特异性PCR(MSP)检测E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化情况。结果1、测序结果证明已成功构建HPV16E6 shRNA慢病毒沉默质粒,荧光显微镜下观察可见绿色荧光,检测包装纯化后的慢病毒滴度为5×108TU/ml,经嘌呤霉素稳筛后shRNA E6组HPV16E6 mRNA水平较另两组明显下降(P0.01),提示已成功筛选出稳转细胞系。2、shRNA E6组的E-cadherin mRNA及蛋白表达水平较另两组显著上调(P0.01),而空载体组及空白组间差异无统计学意义,同时shRNA E6组SiHa细胞的增殖及迁移能力均较另两组明显减弱(P0.05)。3、shRNA E6组SiHa细胞中的E-cadherin基因非甲基化扩增呈阳性,甲基化扩增产物强度较空载体组及空白对照组明显减弱,而空载体组及空白对照组SiHa细胞中的E-cadherin呈完全甲基化状态。结论1、成功构建的shRNA慢病毒沉默载体能够有效沉默HPV16E6基因表达。2、沉默HPV16E6基因上调宫颈癌SiHa细胞E-cadherin的表达水平,降低了SiHa细胞的增殖及迁移能力,同时下调E-cadherin基因启动子区甲基化水平,该甲基化状态的改变导致了E-cadherin重新表达。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33

【参考文献】