溶质载体家族成员5（SLC27A5）调控肝癌细胞的增殖迁移及相关机制研究

发布时间：2020-07-02 02:11

【摘要】：目的:肝细胞肝癌是发病率较高的一种恶性肿瘤,2015年全球新发肝癌病例数超过85万,死亡病例超过81万,其中我国肝癌死亡病例也居高不下,死亡率在癌症中排名第四位。肝癌起病隐匿,常较早发生转移,就诊时往往已是中晚期,加之治疗手段有限,目前肝癌的诊治仍是迫切需要解决的问题。因此积极探索肝癌的发病机制,寻找能预测临床肝癌患者预后的分子标记物,将为肝癌的诊断和治疗提供新思路和理论依据。脂肪代谢在维持细胞内环境稳态上发挥十分重要的作用,同时也是机体内非常重要的代谢途径。脂肪酸是能量代谢的重要底物,并且也是构成生物膜脂质和信号分子的重要组成成分~([1])。恶性肿瘤细胞的重要特征之一是细胞异常增殖,而肿瘤细胞的细胞膜形成和异常信号分子的传递过程需要更多的脂肪酸代谢参与~([2])。脂质代谢改变作为肿瘤的一个重要代谢特点,表现为脂肪酸从头合成和氧化代谢活跃,这揭示癌变细胞可能会通过加强从头合成来增加其所需的脂肪酸,从而为肿瘤细胞的高速增殖提供能量~([3])。SLC27(solute carrier family 27)编码的蛋白称为脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport proteins,FATPs),它们属于介导长链和极长链脂肪酸跨膜转运的载体蛋白家族,在动物组织细胞脂肪酸和脂肪代谢中发挥重要作用。SLC27A5(solute carrier family 27 member 5)作为脂肪酸转运蛋白家族的成员,在肝脏特异高表达,提示其对于肝脏的脂肪酸代谢具有重要的调控作用。有文献报道,SLC27A5基因敲除小鼠肝细胞脂肪酸吸收率降低了50%,游离脂肪酸和甘油三酯含量相应降低,且未发现FATPs其他家族成员有代偿性表达升高,说明肝细胞SLC27A5对长链脂肪酸的摄取、维持肝脏脂质平衡均发挥了非常重要的作用~([4])。但是SLC27A5对肝癌发生发展的影响及相关的机制尚未有相关文献报道,课题组前期实验中,通过GEO数据库筛选到肝癌组织差异低表达基因SLC27A5,TCGA数据库分析也证实了其在肝癌组织中低表达。因此本实验主要研究SLC27A5对肝癌细胞增殖迁移能力的影响及其相关机制探讨。实验方法:1、通过GEO数据库筛选到肝癌组织差异低表达基因SLC27A5,运用生物信息学方法进一步分析TCGA数据库SLC27A5在肿瘤组织和癌旁组织的表达情况,分析SLC27A5表达与患者预后之间的关系。2、采用Western blot、qRT-PCR和免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)方法检测SLC27A5在40对临床肝癌和癌旁组织的表达。采用Western blot检测SLC27A5在正常肝脏细胞和不同肝癌细胞系中的表达。3、运用基因重组技术构建SLC27A5过表达质粒,利用AdEasy腺病毒载体系统构建Ad SLC27A5重组腺病毒表达载体。肝癌细胞感染AdSLC27A5重组腺病毒,采用MTS实验、Edu(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)实验和直接克隆形成实验,检测SLC27A5对肝癌细胞增殖能力的影响;采用transwell小室实验和划痕实验检测SLC27A5对肝癌细胞迁移能力的影响。4、运用转录组测序技术方法及查阅文献,选取与肿瘤增殖迁移相关的靶基因SLC39A6(solute carrier family 39 member 6),IGFBP1(insulin-like growth factor binding protein 1)和TXNRD1(Thioredoxin reductase 1),采用qRT-PCR和Western blot,分别在mRNA和蛋白水平验证靶基因的表达改变。5、采用Western blot、qRT-PCR和IHC方法检测SLC27A5和其下游靶基因TXNRD1在肝癌和癌旁组织的表达相关性。采用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)和Western blot方法检测Nrf2的核转位。6、裸鼠皮下成瘤实验检测SLC27A5对体内肿瘤形成能力的影响。运用Western blot、qRT-PCR和IHC方法在体内进一步验证SLC27A5和其下游靶基因TXNRD1的相关性。结果:1、采用Western blot、q RT-PCR方法检测了40对肝癌和癌旁组织标本SLC27A5的表达情况,Western blot结果发现有27对标本SLC27A5表达呈下调趋势,占67.5%,qRT-PCR检测发现SLC27A5表达也明显降低,且差异具有统计学意义(P0.01)。采用IHC方法检测了18对肝癌和癌旁组织标本,发现SLC27A5在肝癌组织中表达下调,其在细胞内定位主要位于胞浆。说明SLC27A5在肝癌组织的表达明显低于癌旁组织。2、构建SLC27A5重组腺病毒质粒并包装成重组腺病毒,通过Western blot鉴定其过表达效果;通过MTS、EdU及直接克隆形成实验,检测SLC27A5过表达对细胞增殖功能的影响。MTS结果显示:与Mock组和AdGFP组相比,AdSLC27A5组在细胞接种后96h开始生长速度减慢,且在120h时表现最明显;EdU实验结果显示:与Mock组和AdGFP组相比,AdSLC27A5组细胞内新合成的DNA明显减少;直接克隆形成实验结果显示:AdSLC27A5组细胞克隆形成数相较于Mock组、AdGFP组明显减少;通过wound healing实验与transwell小室实验检测SLC27A5过表达对细胞迁移侵袭能力的影响,wound healing实验显示:AdSLC27A5组与Mock组、Ad GFP组比较,细胞迁移率明显降低;transwell小室实验显示:AdSLC27A5组的细胞迁移侵袭数目明显低于Mock组、AdGFP组。说明SLC27A5在体外具有抑制肝癌细胞增殖和迁移的能力。3、通过RNA-Seq筛选到SLC27A5相关的靶基因TXNRD1,运用Real-time PCR和Western bolt的方法验证其mRNA和蛋白表达水平,发现当SLC27A5过表达时,TXNRD1水平降低,并且两者的表达具有相关性;运用Western bolt和免疫荧光技术检测调控TXNRD1表达的上游重要信号分子Nrf2的表达情况,发现当SLC27A5过表达时,Nrf2在胞核中的蛋白水平下降及其荧光表达减弱。说明SLC27A5通过调控keap1/Nrf2信号通路,从而下调TXNRD1的表达。4、分别将MHCC-97H细胞、感染Ad GFP的MHCC-97H细胞和感染Ad SLC27A5重组腺病毒的MHCC-97H细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况,6周后处死裸鼠。实验结果发现,AdSLC27A5组的裸鼠皮下肿瘤重量、体积明显小于对照组;通过荧光定量PCR、蛋白印迹法及免疫组化染色技术,在体内肿瘤组织中验证SLC27A5与TXNRD1之间的负相关关系。说明在裸鼠荷瘤模型SLC27A5能够抑制肿瘤的形成。结论:SLC27A5通过Keap1/Nrf2信号通路靶向下调TXNRD1从而抑制肝癌细胞的增殖。在本课题中,我们首次检测了SLC27A5在肝癌组织中的表达情况,并在体内外实验中探讨其对肝癌细胞增殖迁移作用的影响,本课题尝试揭示SLC27A5抑制肝癌细胞增殖的可能机制,并有望为肝癌的临床诊治提供新的思路。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

模型图,脂肪酸代谢,癌细胞增殖,脂肪酸

A B 1 A、细胞内脂肪酸代谢回顾；B 细胞内限制脂肪酸途径可能抑制癌细胞增殖的模型[24]脂肪酸转运蛋白（FATPs）的主要生物学功能溶质载体家族 27（Solute Carrier Family 27A，SLC27A），又称脂肪酸转运白家族（FattyAcid Transporters，FATPs），由 Schaffer 等首先在小鼠的 3T3-L1肪细胞 cDNA 文库中通过克隆表达技术发现。目前，在人和鼠的基因组中已确了 6 个成员家族（FATP1-6)[24-25]。SLC27A5 编码的蛋白为脂肪酸转运蛋白 5FATP5），因 FATP5 蛋白具有酰基辅酶 A 的功能，所以又被称为极长链酰基辅 A 合成酶同工酶（Very Long-Chain Acyl-CoA Synthetase Homolog）[26]。SLC27A5因位于 19 号染色体，编码的蛋白分子量为 75kD，在肝脏中特异表达。SLC27A5要的生物活性包括：一、作为脂肪酸转运蛋白家族的一员，能增加长链脂肪酸极长链脂肪酸的摄取；二、具有酰基辅酶 A 合成酶活性，参与肝脏中的脂质合

序列,人正常肝,和肝,蛋白表达

2.1 Western bolt 检测 SLC27A5 在人正常肝脏细胞和肝癌细胞的蛋白表达 protein expression of SLC27A5in human normal liver cells and hepatocarcinoC27A5 重组腺病毒质粒的构建与鉴定胶电泳结果显示，目的基因 SLC27A5 经 PCR 扩增的片段大小约d-Track-SLC27A5 载体经限制性内切酶 KpnI 和 HindⅢ双酶切后与扩增片段大小一致，pAdEasy-SLC27A5 重组腺病毒质粒经 Pa小与扩增片段大小也一致，将 DNA 序列送检测序，经 DNA ssis正确，表明 SLC27A5 重组腺病毒载体构建成功（图 2.2）。

【参考文献】