Bmi-1对膀胱癌细胞顺铂耐药性的影响及其机制的研究

发布时间：2020-07-03 14:10

【摘要】：目的膀胱癌(Bladdercancer)是我国发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤之一,也是全身十大最常见肿瘤之一。世界范围内膀胱癌的发病率居恶性肿瘤的第九位,在男性排名第四位,女性排在第十一位。部分膀胱癌患者在初诊或者治疗过程中出现复发或者转移无法进行根治性手术只能进行姑息性化疗。以铂类为基础的联合化疗方案GC方案(吉西他滨+顺铂)和MAVC方案(甲氨蝶呤+阿霉素+长春新碱+顺铂)为目前一线的膀胱癌化疗方案,遗憾的是这些以顺铂为代表的化疗方案虽然在一定程度上能延长患者的生存期,但是总体的预后依旧很差,有效率仅约为35%-60%,其中一个重要的原因是膀胱癌细胞产生了一定程度的耐药性。目前认为药物从细胞内转运到细胞外是肿瘤细胞产生耐药性的一个重要的机制,而多药耐药相关基因MDR1所编码表达的P-gp能发挥将药物从细胞内转运到细胞外的药物转运功能。Bmi-1是一种原癌基因,已经被报道与多种肿瘤的发生和进展都有紧密的关系。课题组前期研究发现对化疗不敏感的膀胱癌患者的肿瘤组织中Bmi-1的表达明显高于对化疗敏感的膀胱癌患者的肿瘤组织,这提示Bmi-1可能与膀胱癌的耐药有着密切的关系。那么膀胱癌中Bmi-1的表达是否会影响MDR1所编码的P-gp的表达从而影响膀胱癌细胞对于顺铂的耐药性目前仍不清楚。所以,我们将探究Bmi-1对于膀胱癌细胞顺铂耐药性的影响并探究其机制。方法1.膀胱癌顺铂与吉西他滨耐药细胞系的建立及生物学特征分析(1)采用浓度交替递增法以较低浓度顺铂处理亲本膀胱癌细胞T24,待其恢复后改用较低浓度的吉西他滨处理,之后逐步交替提高处理的顺铂和吉西他滨浓度直到细胞能在含有一定浓度的顺铂(DDP)或者吉西他滨(GEM)的培养液中稳定的生长传代。(2)利用Western-blot技术检测T24与T24/DDPGEM中的P-gp的表达。(3)利用CCK-8法测定T24与T24/DDPGEM对于顺铂和吉西他滨的半数抑制浓度并计算耐药指数RI。(4)于倒置相差显微镜下观察T24与T24/DDPGEM的形态。(5)应用CCK-8法绘制T24与T24/DDPGEM的生长曲线并计算倍增时间。(6)利用流式细胞术检测T24与T24/DDPGEM的细胞周期比例。(7)CCK-8实验检测T24/DDPGEM与T24对于顺铂和吉西他滨耐药性的差异。(8)流式细胞术检测T24/DDPGEM与T24对于顺铂和吉西他滨耐药性的差异。2.Bmi-1在耐药膀胱癌中的表达及对膀胱癌细胞顺铂耐药性的影响(1)应用免疫组化的方法检测临床上对化疗敏感与不敏感的患者的肿瘤组织中Bmi-1的表达。应用Western-blot实验检测膀胱癌耐药细胞T24/DDPGEM与T24细胞中Bmi-1的表达。(2)在膀胱癌细胞中干扰和过表达Bmi-1。(3)利用CCK-8法检测Bmi-1对于顺铂耐药性的影响。(4)利用CRISPR/Cas9系统在膀胱癌耐药细胞中敲除Bmi-1后,利用CCK-8法和流式细胞术测定顺铂耐药细胞Bmi-1基因敲除后对于顺铂耐药性的变化。3.Bmi-1影响膀胱癌细胞顺铂的耐药性的机制(1)干扰和过表达Bmi-1的表达后检测P-gp的表达。(2)利用Rodamin123检测膀胱癌耐药细胞的Bmi-1基因敲除后药物转运能力的变化。4.Bmi-1影响P-gp表达的可能的机制(1)miRNA 芯片(2)差异miRNA分析(3)Targetscan数据库预测(4)实时定量PCR验证Bmi-1与hsa-miRNA-3682-3p的关系(5)双因素酶报告基因实验验证hsa-miRNA-3682-3p能与P-gp的mRNA的3' UTR直接结合5.Bmi-1对于膀胱癌化疗后的临床意义(1)Bmi-1与膀胱癌临床指标的相关性(2)Bmi-1作为膀胱癌化疗后进展及死亡的独立危险因素的单因素与多因素分析(3)生存分析结果1.膀胱癌顺铂与吉西他滨耐药细胞系的建立及生物学特征分析(1)采用浓度交替递增法成功建立了膀胱癌顺铂与吉西他滨耐药细胞系T24/DDPGEM,其能在含有在终浓度为0.5ug/ml DDP或者2.5ug/ml GEM的培养液中稳定生长和传代。(2)经过Western-Blot检测,T24/DDPGEM的P-gp表达量显著提高。(3)CCK-8法测定计算出T24/DDPGEM细胞对于顺铂和吉西他滨的半数抑制浓度IC50分别为4.93±0.42μg/ml与45.97±3.35μg/ml。T24细胞对于顺铂和吉西他滨的半数抑制浓度IC50分别为1.16±0.24μg/ml与0.73±0.12μg/ml,T24/DDPGEM对于顺铂和吉西他滨的耐药指数RI分别为4.25和62.97。(4)倒置相差显微镜下,亲本T24细胞成圆形,椭圆形,边界清楚,大小均匀,贴壁生长。T24/DDPGEM细胞体积变大,异型性显著,形态明显不规则,细胞内可见空泡和颗粒形成。(5)与亲本T24细胞比较,T24/DDPGEM的生长减缓。T24的倍增时间为(28.06±0.76)h,T24/DDPGEM 的倍增时间为(39.51±0.36)h 两者比较有统计学意义(P0.001)。倍增时间延长(11.45±0.41)h。(6)经流式细胞仪对T24/DDPGEM和T24细胞周期分布分析,与T24细胞比较,T24/DDPGEM的G1期的细胞比例显著增多,S期和G2期的细胞比例显著减少。(7)相较于T24细胞,T24/DDPGEM对于顺铂和吉西他滨有着显著提高的耐药性。2.Bmi-1在耐药膀胱癌中的表达及对膀胱癌细胞顺铂耐药性的影响(1)通过免疫组化实验发现临床上对于化疗不敏感的膀胱癌患者的肿瘤组织切片中Bmi-1的表达明显高于对于化疗敏感的膀胱癌患者。膀胱癌耐药细胞T24/DDPGEM的Bmi-1的表达量明显高于T24细胞。(2)Western Blot实验证实构建的3个Bmi-1的shRNA干扰质粒能够有效地干扰Bmi-1在T24和Biu-87细胞中的表达并选择其中1个进行后续实验,T24和Biu-87细胞转染过表达质粒后成功过表达Bmi-1。(3)通过CCK-8法证实干扰Bmi-1能够降低膀胱癌细胞对于顺铂的耐药性,过表达Bmi-1能够提高膀胱癌细胞对于顺铂的耐药性。(4)成功构建敲除Bmi-1的CRISPR/Cas9系统,用慢病毒包装并转染了膀胱癌耐药细胞株。通过Western-blot实验证实了 Bmi-1的表达量显著下降。通过CCK8法和凋亡检测发现其耐药性发生了逆转。3.Bmi-1影响膀胱癌细胞顺铂的耐药性的机制(1)通过Western-blot实验发现在膀胱癌细胞中Bmi-1可以影响P-gp的表达。(2)通过Rodamin 123发现敲除Bmi-1之后膀胱癌耐药细胞株药物转运能力明显下降。4.Bmi-1影响P-gp表达的可能的机制(1)miRNA 芯片。(2)差异miRNA分析。的表达,从而上调P-gp。(4)实时定量PCR结果显示Bmi-1可以负向调节hsa-miRNA-3682-3p的表达。(5)双荧光素酶报告基因实验结果显示hsa-miRNA-3682-3p可以直接结合P-gp 的 mRNA 的 3'UTR。5.Bmi-1在膀胱癌化疗后的临床意义(1)相关性分析结果显示Bmi-1与膀胱癌的分级、分期以及淋巴结转移情况有着显著的关系。(2)单因素与多因素分析显示Bmi-1高表达是膀胱癌的化疗后进展和死亡的危险因素。(3)生存分析结果显示,Bmi-1高表达的膀胱癌病人在化疗后有着较低的生存率。结论1.膀胱癌耐药细胞株T24/DDPGEM构建成功,具有稳定的对于顺铂和吉西他滨的耐药性,可以作为研究膀胱癌耐药的很好的模型。2.Bmi-1在膀胱癌耐药细胞株和临床的化疗不敏感的患者的肿瘤组织标本中高表达,提示Bmi-1可能与膀胱癌的耐药有密切关系。在膀胱癌细胞中干扰Bmi-1可以降低其对于顺铂的耐药性,过表达Bmi-1可以提高其对于顺铂的耐药性,在膀胱癌耐药细胞中敲除Bmi-1可以逆转耐药细胞对于顺铂的耐药性。3.在膀胱癌中Bmi-1是通过影响P-gp的表达,从而影响膀胱癌细胞转运药物的能力,继而影响其对于顺铂的耐药性的4.Bmi-1 可以抑制 hsa-miRNA-3682-3p 的表达,而 hsa-miRNA-3682-3p 可以直接结合P-gp的mRNA的3'UTR。5.Bmi-1与膀胱癌化疗的预后有着密切的关系。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14
【图文】：

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本文编号：2739767