四跨膜蛋白TSPAN12在非小细胞肺癌中的功能及其机制研究

发布时间：2020-07-03 08:53

【摘要】：[研究背景]非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)是目前世界上癌症死亡率较高的肿瘤之一,约占所有肺癌死亡率的85%。最常见的NSCLC类型主要包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌,但也有其它几种少见的类型。其中,原癌基因和抑癌基因的异常表达参与了NSCLC的致癌和发展,从而导致了肿瘤细胞的生长和转移。与小细胞肺癌相比,NSCLC病人往往对化疗不敏感,因此,NSCLC在临床上治疗比较棘手。但是,目前临床上化疗依然被用于治疗非小细胞肺癌,包括术前(新辅助化疗)和术后(辅助化疗),手术切除仍是主要的治疗方法,但病人治疗后的5年总生存率仅为16%。考虑到NSCLC的复杂性以及有效治疗药物的缺乏,发现参与NSCLC起始和进展的相关分子机制,对于研发抗NSCLC有效药物以及发现新的治疗方法具有重要的理论指导意义。其中,四跨膜蛋白12(TSPAN12)属于四跨膜蛋白家族一员,最初发现,TSPAN12与家族渗出性玻璃体视网膜病变的眼血运受损有关,而近期研究发现,TSPAN12与肿瘤的发生发展密切相关。然而,TSPAN12在肺癌中的功能及其作用目前尚不清楚。本研究通过相关试验研究TSPAN12在NSCLC发生发展中的作用及其机制,希望对NSCLC的诊断及治疗提供新的靶标和治疗策略。[材料与方法]选取南京医科大学附属淮安一院16例NSCLC患者手术后癌组织和相应的癌旁组织,使用免疫组织化学法比较NSCLC组织和正常邻近组织中TSPAN12的表达水平,并通过q RT-PCR和Western blot技术检测组织中TSPAN12的m RNA以及蛋白表达水平。接着,我们通过慢病毒感染建立了TSPAN12表达下调的A549和H1299稳转细胞系,然后采用Western blot和q RT-PCR检测TSPAN12在这些细胞中的表达水平。MTT试验用来观察TSPAN12对NSCLC细胞生存和增殖能力的影响。同时,利用流式细胞分析术检测沉默TSPAN1后NSCLC的细胞周期和凋亡的变化。然后,利用免疫荧光染色技术检测沉默TSPAN12后,A549和H1299细胞中p53的表达水平。同时,采用Western blot方法检测沉默了TSPAN12后A549和野生型P53质粒转染的H1299细胞中p21、p27和p53的表达水平。最后,建立裸鼠异种移植肿瘤模型,分析TSPAN12下调对异种生物体内肿瘤生长的影响。[结果]TSPAN12在体外和体内均能调节NSCLC细胞的生长。与相应的癌旁正常组织相比,人NSCLC标本中TSPAN12的m RNA水平显著升高。此外,在NSCLC中上调的TSPAN12表达与p53表达呈反比关系。同时,与人类支气管上皮细胞(16HBE)相比,TSPAN12在其它三种人NSCLC细胞系中也呈现高表达。然后,我们研究了sh RNA沉默TSPAN12对NSCLC细胞体外生长和体内肿瘤生长的影响,以及体外对p53表达的影响。在NSCLC细胞中敲低TSPAN12可抑制细胞增殖和克隆形成。此外,敲低TSPAN12会增加NSCLC细胞的凋亡。从机理上讲,TSPAN12可以调节NSCLC细胞中p53、p21和p27的表达。在肿瘤异种移植模型中,沉默TSPAN12可抑制H1299细胞介导的肿瘤生长。[结论]本文研究表明,TSPAN12在NSCLC中起着重要的作用,是一种潜在的生物标志物,在NSCLC的治疗中可能是一个潜在的治疗靶点。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

免疫组化法,肺癌组织,评分公式,免疫组织化学

2.1 TSPAN12在人NSCLC肿瘤组织中高表达为了检测TSPAN12在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达，我们用免疫组化法检测了TSPAN12在癌旁组织和肺癌组织中的表达。如图1A所示，从免疫组化染色看，TSPAN12在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁正常组织。接着，根据免疫组织化学评分公式，评分范围0-300，对TSPAN12的表达进行定量分析，如图1B所示，大多数NSCLC组织（68.8%

细胞凋亡,表达水平

图3A和3B所示，沉默TSPAN12可显著促进细胞凋亡。结合图2我们可以得出结论，TSPAN12可通过调节细胞凋亡来影响NSCLC细胞的增殖。图3. 沉默TSPAN12促进NSCLC细胞凋亡。(A) 流式细胞术检测沉默TSPAN12后，A549和H1299细胞的凋亡情况。(B) Q2加Q4象限的值代表细胞凋亡率。数据以平均±SD表示。*p<0.05。 (C) 用免疫荧光染色法检测A549和H1299细胞中沉默TSPAN12基因后p53的表达水平。(D) 进行Western blot分析，以评估A549和H1299细胞中敲低TSPAN12后细胞中p21、p27和p53的表达水平。

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