肿瘤细胞来源的微颗粒介导肠粘膜抗肿瘤免疫的初步探讨

发布时间：2020-07-05 04:43

【摘要】：目的:肠道粘膜免疫系统作为全身免疫系统的重要组成部分,深刻影响肿瘤的发生发展。通过口服肿瘤疫苗的模式重塑肠道粘膜免疫,进而诱导系统性抗肿瘤免疫保护作用,这可能是一种全新的肿瘤免疫途径。肿瘤细胞来源的微颗粒(tumor cell-derived microparticles,T-MPs)是当肿瘤细胞受到外界刺激或发生凋亡时,通过改变细胞骨架结构而向胞外释放的一类直径位于100到1OOOnm之间、由细胞膜包裹细胞质内容物的囊性小泡。我们前期的研究已经证实T-MPs同时携带有肿瘤抗原和DNA等固有免疫信号分子,其特有的脂筏结构具有极好的理化稳定性,且将T-MPs作为疫苗进行皮下免疫获得了理想的效果。在此基础上,本研究将T-MPs作为口服疫苗,深入探索T-MPs介导的肠道粘膜免疫系统的改变,阐明肠道抗肿瘤免疫应答的相关机制,为开发新型口服肿瘤疫苗提供可能。方法:(1)为了证明口服T-MPs能体内抑制肿瘤生长,我们分别提取B16-MPs和CT-26-MPs 口服免疫小鼠,再皮下接种相应肿瘤细胞,绘制肿瘤生长曲线;为了证明口服T-MPs引起的免疫反应具有抗原特异性,我们用OVAB16-MPs、B16-MPs和Ovalbumin 口服免疫小鼠,再皮下接种OVAB16细胞;为证明T-MPs比肿瘤细胞裂解物和凋亡肿瘤细胞更具优势,我们用B16-MPs、B16细胞裂解物和凋亡B16细胞口服免疫小鼠,再皮下接种B16细胞;用B16-MPs 口服免疫裸鼠研究T-MPs介导的免疫应答类型。(2)为了探索口服T-MPs是否能介导肠道局部和全身性T细胞免疫应答,我们用B16-MPs 口服免疫小鼠,使用流式细胞染色检测脾脏和肠系膜淋巴结(MLN)IFN-γ+的CD8+和CD4+T细胞比例以及其他CD4+ T细胞亚群的比例,使用qPCR检测相关细胞因子的表达;利用口服免疫OVAB16-MPs再分离淋巴细胞进行体外二次刺激的方式,流式检测IFN-γ的产生,证明T-MPs可在体内诱导特异性T细胞。(3)建立小鼠体内DCs条件性清除和重建模型,通过流式检测IFN-γ+的CD8+和CD4+T细胞比例判断T-MPs诱导的T细胞免疫是否被启动,研究DCs是否参与T-MPs介导的抗肿瘤T细胞免疫。(4)为了研究T-MPs在肠道的摄取情况,给小鼠口服PKH26-T-MPs,于多个时间点流式检测不同肠段细胞对T-MPs的摄取情况;将肠道细胞分为CD45+免疫细胞和CD45-非免疫细胞两类,使用流式和免疫荧光的方法检测PKH26-T-MPs被何种细胞摄取;利用细胞骨架抑制剂秋水仙碱研究肠上皮细胞(IECs)对T-MPs的转吞作用。(5)先给小鼠口服H22-MPs,再用流式和免疫荧光的方法检测肠道CD11c+,CD103+以及CD3+CD8+细胞的比例,研究T-MPs对肠道免疫细胞的动员情况;同时用qPCR和ELISA从基因和蛋白水平检测IECs趋化因子的表达,研究肠道免疫细胞的迁移是否与趋化因子有关。(6)为探索IECs产生趋化因子的信号传导问题,我们使用Western blot和免疫荧光的方法检测摄取了 H22-MPs的IECs内MAPK和NF-κB的活化情况,并利用MAPK和NF-κB抑制剂反向证明;为进一步研究MAPK和NF-κB信号的上游分子,我们通过qPCR和Western blot检测摄取了 H22-MPs的IECs内NOD受体的表达,并用基因敲除鼠再次检测MAPK和NF-κB的活化、趋化因子的表达、免疫细胞的募集和口服T-MPs的肿瘤生长抑制作用。结果:(1)将B16-MPs和CT-26-MPs分别口服免疫小鼠,再皮下接种相应肿瘤细胞,结果B16-MPs和CT-26-MPs在不同品系的小鼠都有很好的肿瘤生长抑制作用;口服免疫OVAB16-MPs比B16-MPs和Ovalbumin有更显著的抗OVAB16肿瘤作用;口服免疫B16-MPs比相应细胞裂解物和凋亡细胞能更有效地抑制B16肿瘤的生长;口服B16-MPs在裸鼠体内不能抑制肿瘤生长。(2)用B16-MPs 口服免疫小鼠后,发现MLN和脾脏分泌IFN-γ的CD8+和CD4+ T细胞比例增加,而CD4+ T细胞其他亚群的比例没有改变,且Th1相关细胞因子表达上调;分离口服OVAB16-MPs、B16-MPs和Ovalbumin小鼠的淋巴细胞进行体外OVA肽二次刺激时,OVAB16-MPs组可产生更多IFN-γ。(3)用DT清除CD11c-DTR小鼠的DCs,再通过额外DCs的过继进行重建,结果显示DCs的清除不改变IFN-γ+ T细胞的比例,而DCs的重建恢复了 T-MPs诱导的IFN-γ+T细胞的比例增加。(4)给小鼠灌胃PKH26-T-MPs,发现T-MPs在1h被回肠摄取最多,且摄取了 T-MPs的细胞主要是IECs,而CD11c+CD103+DCs只摄取少部分;使用秋水仙碱抑制IECs的转吞作用,发现DCs获取的T-MPs是由IECs释放而来。(5)小鼠口服H22-MPs后,发现回肠细胞中CD11c+,CD103+以及CD3+CD8+细胞的比例增加;同时回肠IECs会在基因和蛋白水平上调表达趋化因子CCL2,CCL20和CX3CL1,其中CCL2上调程度显著且维持时间最长。(6)发现摄取了 T-MPs的IECs胞内的ERK和p38的磷酸化水平增加,NF-κB入核,使用抑制剂能阻断CCL2的上调表达;摄取了 T-MPs的IECs胞内的NOD2受体在基因和蛋白水平均上调表达,在NOD2敲除小鼠体内,MAPK和NF-κB的活化、CCL2的表达增加、CD103+DCs和CD8+T细胞的迁移募集以及口服T-MPs抑制肿瘤生长的现象均被阻断。结论:T-MPs经口服途径到达肠道后,大部分能够被回肠上皮细胞摄取,一方面,T-MPs与IECs胞内的NOD2受体作用,活化下游的MAPK和NF-κB信号,导致以CCL2为主的趋化因子的上调表达和释放,进而募集CD103+DCs;另一方面,T-MPs被IECs经转吞作用从肠腔面转运到基底面,从而被迁移来的CD103+DCs捕获并抗原提呈,引发肠道粘膜局部和全身系统性抗肿瘤T细胞免疫应答。T-MPs作为肿瘤口服疫苗不仅具有有效性和广谱性,且比其他肿瘤疫苗成分具有更大优势。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.51
【图文】：

再给所有组小鼠皮下接种Ｂ１６肿瘤细胞。结果显示，与ＰＢＳ对照组相比，只有逡逑口服免疫Ｂ１６－ＭＰＳ能显著抑制Ｂ１６肿瘤生长，而口服免疫Ｂ１６细胞裂解物和逡逑凋亡Ｂ１６细胞却没有抗肿瘤效果（图３）。这说明口服Ｔ－ＭＰｓ比口服其他肿瘤疫逡逑苗成分能介导更强大的免疫保护作用，暗示了通过口服途径，Ｔ－ＭＰｓ比其他肿逡逑瘤疫苗成分具有更大优势。逡逑３６逡逑

再给所有组小鼠皮下接种Ｂ１６肿瘤细胞。结果显示，与ＰＢＳ对照组逡逑相比，口服Ｂ１６－ＭＰＳ并不能介导与之前实验结果相似的抗肿瘤免疫效应，对Ｂ１６逡逑肿瘤的生长无抑制作用（图４）。这说明当小鼠体内没有Ｔ细胞时，口服Ｔ－ＭＰｓ逡逑的抗肿瘤效应便不能发挥，暗示了口服Ｔ－ＭＰｓ疫苗介导的免疫保护作用是Ｔ细逡逑胞依赖的。逡逑３７逡逑

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本文编号：2742102