NeuroD1在胃神经内分泌癌中的表达与功能研究

发布时间：2020-07-07 01:16

【摘要】：目的:本研究通过转录组测序技术探索胃神经内分泌癌(GNEC)的转录组学景观,并以GNEC特异性上调表达的Neuro D1为焦点,探讨其在GNEC中的表达及其对GNEC生物学功能的影响。方法:本研究采用新一代高通量测序技术RNA-seq对研究的组织样本进行转录组测序;采用RT-qPCR和western blot技术分别检测Neuro D1的m RNA和蛋白表达情况;采用免疫组化法检测Neuo D1在50例GNEC患者石蜡组织切片中的表达情况并做相关的预后分析;采用CCK8法和SRB法检测细胞的增殖能力;采用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果:(1)本研究共检测了3对GNEC患者的癌与毗邻癌旁组织以及与3例GNEC临床基本状况(性别、年龄、肿瘤分期)相匹配的3例胃腺癌(GAC)患者的癌组织的转录组学信息,并对其转录组景观进行展示;通过比对GNEC癌与癌旁以及GNEC癌与GAC癌的差异表达基因,得出GNEC特异性表达的上调基因1248个,下调基因6个;并对差异表达基因进行了GO等分析。(2)Neuro D1是GNEC特异性上调表达基因之一,其参与神经与神经内分泌相关的多个进程;Neuro D1在GNEC中的m RNA水平和蛋白水平均呈高表达状态,且在50例的免疫组化结果中还发现Neuro D1高表达影响GNEC患者的预后;我们随后对Neuro D1在GNEC中的功能进行了探索,发现敲弱Neuro D1在GNEC细胞系中的表达会促进细胞的增殖与克隆形成,且会提高GNEC细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。结论:GNEC的转录组学景观存在组织特异性,其特异性表达基因Neuro D1不仅影响GNEC患者的远期预后且也会影响GNEC细胞的增殖和克隆形成能力以及对5-Fu的敏感性。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

网络图,靶点,载体,图谱

用 DESeq2 进行基因表达差异分析，对表达差异分析结果进行可视异基因映射到 STRING 蛋白互作网络数据库上进行蛋白互作网络于差异分析结果，绘制韦恩图、热图，并进行聚类分析。因富集分析用 topGO 进行 GO 富集分析，并绘制显著性 GO 有向无环图；用 clusterProfiler 进行 KEGG 通路和 KOG 分类富集分析；于基因功能富集分析结果绘制关联分析网络图。建稳转细胞株建用的干扰载体 pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA 载体图谱如下。用 I 酶切切去 U6 启动子下游的 ccdB 毒性基因，插入待构建的 shR

序列,实验方案,测序

结果内分泌癌组织的转录组学研究组学研究的样本信息与 RNA-seq 测序质控面了解 GNEC 的转录组景观，我们收集了 3 对 GNEC 肿瘤组其毗邻的癌旁组织（N1、N2、N3），并根据 3 个 GNEC 患者的分期等作为配对因素，挑选了 3 个与之匹配的 GAC 患者的肿T8）同期进行 RNA-seq（图 1.1）。我们首先对测序结果进行用碱基测序质量值(Phred quality score, Qphred)描述整体测序g error probabilities, P)进行质量评估，评估标准见表 1.1。测序量平均约为 49088352 个（表 1.2）；为保证数据的分析质量，量的序列过滤清除，最终得到净读段数（表 1.3）；读段长度，将所有读段与人类基因组进行有参比较，共定位到基因数（表 1.4）。

结构分布,结构分布,基因组,样本

图 1.2 各 RNA-seq 样本的读段在基因组中的结构分布2 单核苷酸多态性分析单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)是指基因组中由单个核苷酸变异形成的遗传标记，通常发生的数量较多，且多态性丰富。SNP 常发生的变异类型只有两种，即转换和颠换（图 1.3）。从图中可以看出不管是 GNEC 的癌组织、癌旁组织还是 GAC 的癌组织，碱基转换发生的数量远多于碱基颠换且在 GNEC 癌组织中偏好发生的转换类型为腺嘌呤转（A）为鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）转为胞嘧啶（C）。进一步对 SNP 位点进行基因组定位可以发现 SN最经常发生的位置多集中在内含子中（图 1.4）。对 SNP 数量进行统计可以发现，GNEC 中发生 SNP 的数量最多，且其特有的 SNP 数高达 18150 个（表 1.5）。

【相似文献】