DNA损伤修复相关基因MDC1和YAP1在卵巢癌发生发展中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-07 00:14

【摘要】：卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤,其死亡率高居所有妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌患者早期通常无明显症状,这使其早期诊断较为困难,且疾病后期易发生复发转移,导致卵巢癌死亡率一直居高不下。现有的手术治疗与化疗可在一定程度上减少卵巢癌患者的肿瘤负荷,但却无法显著改善患者的远期生存。究其根本,在于我们对卵巢癌发生发展的分子机制尚不完全清楚。目前卵巢癌的诊治仍是临床一大难题,主要原因是缺乏针对卵巢癌的特异性高、敏感性好的早期筛查方法,且在卵巢癌的后期治疗过程中易发生复发及化疗耐药。寻找可用于卵巢癌早期筛查的特异性分子和新的卵巢癌治疗靶点将有助于改善卵巢癌的预后,因此,对卵巢癌发生发展过程中分子机制的研究迫在眉睫。DNA损伤修复是指在基因组DNA受到损伤后发生的一系列修复过程。DNA损伤包括内源性损伤,如细胞代谢产物的损伤,以及外源性损伤,如辐射或化疗药物造成的损伤。DNA损伤修复在肿瘤发生发展过程中所起到的作用有其两面性,它可能造成基因组DNA错误而诱发肿瘤,但同时,放化疗过程也是利用化疗药物和放疗对肿瘤细胞产生的DNA损伤所发挥治疗作用；DNA损伤修复失败可能是肿瘤发生的诱发因素,而对于放化疗过程产生的DNA损伤修复也会导致肿瘤细胞的放化疗耐受。所以,DNA损伤修复对肿瘤的发生发展有着重要的影响。卵巢癌根据临床病理和分子遗传学特点可划分为2种类型：Ⅰ型多为临床早期病变,局限于卵巢,发展缓慢,预后较好；Ⅱ型具有高度侵袭性,发现时多为临床晚期,预后不良。基于卵巢癌的不同类型进行蛋白质组学分析并获取表达差异蛋白的结果,我们从中挑选出MDDC1 (Mediator of DNA damage checkpoint protein 1)和YAP1 (Yes-associated proteinl)这两个DNA损伤修复相关基因作为本研究的目标分子,探讨其在卵巢癌发生发展过程中的作用及机制。第一部分DNA损伤修复相关基因MDC1在卵巢癌发生发展中的作用及其机制研究研究背景和目的DNA损伤修复过程是肿瘤生物学中的一个重要研究领域。一方面,在理论上人们逐渐认识并接受“DNA损伤修复反应是机体早期抵抗肿瘤发生的重要防线”这一观点,因为参与DNA损伤应答反应的许多基因,如p53和BRCA1等,都是经典的抑癌基因,DNA损伤发生后若细胞不能进行有效应答反应以保持基因组遗传稳定性,则易发生基因突变导致肿瘤发生；另一方面,在临床上利用放疗、化疗等手段来治疗肿瘤正是利用DNA损伤来杀伤肿瘤细胞从而达到治疗目的。在前期对上皮性卵巢癌的不同类型进行蛋白质组学分析所得到的结果中,将卵巢癌不同类型间表达差异蛋白数据集,与卵巢癌和正常组织对照表达差异蛋白数据集,取交集获得MDC1分子。我们发现MDC1这一参与DNA损伤应答反应的重要分子在,因此我们推测它可能在肿瘤发生发展中具有一定作用。近年来在对其它肿瘤的研究中,MDC1被发现可能参与肿瘤的发生发展过程。有研究指出MDC1参与食管癌细胞增殖和细胞周期调控,并对化疗药物阿霉素和顺铂的敏感性产生影响,提示MDCl可以作为食管癌的一个潜在治疗靶点。而Yuan等通过干扰MDC1也验证了MDC1对宫颈癌细胞增殖、细胞周期调控和阿霉素药物敏感性的影响,提示其调控宫颈癌发展过程中的重要进程。另外,MDC1在肿瘤浸润转移过程中同样发挥着重要作用。这些研究进一步支持了我们的推测,表明MDC1可能在卵巢癌的发生发展中起到关键的调节作用。对MDC1的研究,将有助于我们更好地理解卵巢癌发生发展过程的分子机制,并有可能为卵巢癌的治疗提供新的靶点,以改善卵巢癌的预后。研究方法本课题为了探究MDC1在卵巢癌发生发展过程中的作用,首先从组织学角度检测MDC1表达水平与预后的关系。然后从体外实验角度,通过上调和下调目的基因MDC1的表达水平,进而研究其发生的生物学行为改变,如MDC1在卵巢癌中是否起到调节肿瘤浸润转移的作用,是否影响肿瘤的上皮间质转化等,并在体内实验水平进一步验证体外实验结果。研究结果1.MDCl表达水平与卵巢癌预后的关系为探究卵巢癌中MDC1表达水平与预后的关系,我们对130例卵巢癌石蜡组织切片进行免疫组化检测,根据其表达水平分为MDC1高表达和低表达组,并进行生存分析。Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明,MDC1高表达组明显较MDC1低表达组预后差(P=0.0052)。通过对MDC1高表达和低表达组之间患者年龄、FIGO分期等潜在相关因素的进一步分析,我们发现MDC1高表达组年龄较低表达组偏低(P=0.043),而与其他因素则无明显相关性。2.MDC1干扰及过表达细胞系的构建我们成功构建了MDCl干扰载体pGIPZ-shMDC.1和过表达载体pLenti-MDC1,并从mRNA和蛋白水平检测MDC1在卵巢癌不同细胞系中的表达,选取MDC1表达水平较高的HO8910PM和OVCAR3细胞系进行干扰,选取MDC1低表达细胞系H08910进行过表达,通过细胞转染、稳定筛选等方法获得MDC1干扰及过表达的卵巢癌细胞系。3.MDC1增强卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力我们利用Transwell实验检测MDC1干扰及过表达后对细胞迁移侵袭能力的影响。结果显示MDC1干扰细胞系shMDC1-HO8910PM和shMDC1-OVCAR3的迁移和侵袭能力明显降低,而过表达细胞系MDC1-OVE-HO8910的迁移和侵袭能力则显著增强。证明MDC1在卵巢癌中具有促进肿瘤迁移侵袭的能力。4.MDC1促进卵巢癌细胞的上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)通过对MDC1干扰及过表达细胞系的形态学观察,我们发现过表达MDC1的卵巢癌细胞系与对照细胞相比呈梭形间叶性细胞形态,而MDC1干扰细胞系与对照细胞相比则趋向于多边形上皮样形态,提示MDC1可能促进卵巢癌细胞系的EMT。Western Blot及细胞免疫荧光结果提示,MDCl干扰后上皮性标志分子E-cadherin (E钙黏蛋白)表达上调,而间质标志分子N-cadherin (N钙黏蛋白)等表达下调,MDC1过表达细胞系则相反,这进一步验证了MDC1能够促进卵巢癌细胞的EMT。5.体内实验验证MDC1促进卵巢癌迁移侵袭能力用MDC1干扰细胞系shMDC1-HO8910PM建立裸鼠肺转移模型,从体内实验水平验证MDC1对卵巢癌细胞浸润转移能力的影响。实验结果显示shMDCl-HO8910PM组的裸鼠肺部转移灶数目明显少于对照组,这从体内实验的角度证实了MDC1促进卵巢癌的浸润转移。6.MDC1不影响卵巢癌细胞系的细胞周期和凋亡流式细胞术检测细胞周期改变,发现小干扰RNA (siRNA)干扰MDC1后卵巢癌细胞系周期分布与对照细胞相比并无明显变化。同理,siRNA干扰MDCl后用流式细胞术检测细胞凋亡,发现干扰后卵巢癌细胞凋亡数量与对照细胞相比也无明显改变。以上结果说明MDC1并不影响卵巢癌细胞的细胞周期和凋亡。7.MDC1与顺铂(CDDP)、阿霉素(ADR)药物敏感性无相关性利用四唑盐比色法(MTT)实验检测MDC1干扰后,卵巢癌细胞对化疗药物CDDP和ADR的敏感性,发现干扰MDC1对药物敏感性并无明显影响。结论1.MDC1的表达水平与卵巢癌预后相关,MDC1高表达提示预后较差。2.MDC1通过增强上皮间质转化,从而促进卵巢癌的浸润转移。3.MDCl不影响卵巢癌细胞周期和凋亡,且与CDDP和ADR药物敏感性无关。第二部分DNA损伤修复相关基因YAP1在卵巢癌发生发展中的作用及其机制研究研究背景和目的YAP1是Hippo信号转导通路下游重要的转录共激活因子。Hippo信号通路主要通过促进细胞凋亡和抑制细胞增殖调控器官发育大小,而YAP1是该信号通路的靶因子。YAP1在哺乳动物中功能域保守,在组织和器官中广泛表达,在正常细胞中发挥着信号转导和基因转录调节作用,同时参与细胞增殖和细胞凋亡的调控。近年来多项研究发现YAP1在多种恶性肿瘤中高表达,可促进肿瘤的发生发展。同时,YAP1也是参与DNA损伤修复的关键基因,有研究表明,YAP家族作为转录因子能够参与DNA损伤修复,并提示该机制可能与临床化疗敏感性相关。结合蛋白质组学相关研究结果,我们推测对YAP1的研究将有助于解释卵巢癌细胞生长机制,同时为卵巢癌临床治疗提供新的靶点。研究方法通过免疫组化检测YAP1在卵巢癌组织中的表达,分析YAP1表达位置、表达水平与预后的关系。通过上调和下调YAP1基因的表达水平,对YAP1干扰和过表达后细胞的生物学行为改变进行研究,检测YAP1在卵巢癌中是否起到促进肿瘤增殖的作用。MTT实验检测YAP1是否调节卵巢癌细胞系对CDDP的敏感性。最后通过实时定量PCR实验对YAP1下游靶基因进行初步筛选。研究结果1.YAPl核表达水平与卵巢癌预后的关系为探究卵巢癌中YAP1表达水平与预后的关系,我们对76例卵巢癌石蜡组织切片进行免疫组化检测,发现YAP1在胞浆和胞核中均有表达,根据YAP1核表达水平分为YAP1核高表达和YAP1核低表达组,根据YAP1胞浆表达水平分为YAP1胞浆高表达和YAP1胞浆低表达组,并分别进行生存分析。Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明,YAP1核高表达组与YAP1核低表达组相比其预后明显较差(P=0.0163),而YAP1在胞浆中的表达则与预后无关(P=0.7143)。将YAP1在胞浆与胞核中的表达结合起来,对卵巢癌预后有较好的预测作用(P=0.0001)。2.YAP1在卵巢癌组织及细胞系中的蛋白表达水平检测通过免疫组化和Western Blot方法,检测YAP1在正常输卵管伞组织和卵巢癌组织中蛋白表达水平。结果显示YAP1在卵巢癌中的表达较正常输卵管伞组织明显升高。Western Blot检测YAP1在卵巢癌细胞系及正常细胞系中的表达发现,YAP1在卵巢癌细胞系中的表达显著高于永生化的正常输卵管细胞系(FTE187)。3.YAP1干扰及过表达细胞系的构建我们成功构建了YAP1的干扰载体pLKO.1-shYAP1和过表达载体pBABE-YAP1,结合YAP1在不同卵巢癌细胞系中的蛋白表达水平,选取YAP1表达水平较高的H08910和HEY细胞系进行干扰,选取YAP1低表达细胞系A2780和SKOV3进行过表达。通过细胞转染及稳定筛选的方法,获得YAP1干扰及过表达的卵巢癌细胞系。4.YAP1增强卵巢癌细胞系的增殖能力利用增殖相关实验检测YAPl干扰及过表达后对细胞增殖的影响。结果发现YAP1干扰细胞系shYAP1-HO8910和shYAP1-HEY的增殖能力明显降低,而过表达细胞系YAP1-OVE-A2780和YAP1-OVE-SKOV3的增殖能力则显著增强,证明YAP1在卵巢癌中具有促进肿瘤增殖的能力。5.YAP1降低卵巢癌细胞系对CDDP的药物敏感性通过MTT法检测YAP1过表达细胞系与对照细胞系对CDDP药物敏感性的差别,结果显示与对照组细胞相比,YAP1过表达细胞系对CDDP药物敏感性降低。Western Blot检测相关通路分子,结果提示YAP1对CDDP药物敏感性的影响可能与pJNK的上调和pATF2的下调有关。6.YAP1下游靶基因筛选通过调控YAP1的表达情况,用实时定量PCR方法检测YAP1潜在下游靶基因,最终筛选出ATF2、RAD51AP1和MYCL1等基因在多个细胞系中的表达与YAP1具有相关性,提示其可能为YAP1的下游靶基因。结论1.YAP1在卵巢癌中高表达,其核蛋白表达水平与卵巢癌预后相关,YAP1核表达高提示预后差；YAP1促进卵巢癌细胞的增殖；YAP1增强卵巢癌细胞对CDDP的化疗耐药。2.ATF2、RAD51AP1和MYCL1可能是YAP1下游的靶基因。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

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