L-733060对子宫内膜癌细胞的影响

发布时间：2020-07-08 06:16

【摘要】：目的:子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一。近年来随着人口老龄化、人口增长、人口体重增加,子宫内膜癌的发病率逐年增加。全球每年大约有320,000名女性被诊断为子宫内膜癌。尽管子宫内膜癌以I期最为常见,并且采用手术治疗后5年生存率可达到85-90%,但对于III IV期的女性患者即使规范化的手术、放疗及化疗联合治疗后,其5年生存率仅为30-40%。联合化疗可以提高晚期及复发患者的无瘤生存期,但并不提高其总生存时间。美国最近的调查表明其子宫内膜癌五年生存率大约81.8%,每年有近4489名II IV期子宫内膜癌患者死亡,而在发展中国家仅仅为67%。因此新型抗肿瘤药物有待探究。NK-1受体即神经激肽-1受体,是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白偶联受体超家族成员之一,广泛存在于中枢神经系统和外周器官,包括纹状体、脑干、脊髓、胃肠道、膀胱、甲状腺、各种免疫细胞、肺气道上皮和粘膜下腺细胞,在疼痛、偏头痛、炎症、情绪调控、焦虑、药物滥用、恶心、呕吐等多种生理及病理过程中发挥重要作用。近几十年来,国内外学者研究发现NK-1受体参与多种肿瘤的增生、转移和新血管生成过程。NK-1受体拮抗剂通过与其受体结合发挥抗肿瘤作用。L-733060是一个高选择、高效、长效的非肽类NK-1受体拮抗剂,其在多种肿瘤细胞中具有抗肿瘤作用,但对子宫内膜癌的作用尚没有相关报道。本研究以Ishikawa细胞系为研究对象,采用MTT法、流式细胞仪、Transwell观察其对Ishikawa细胞增殖、凋亡、细胞周期和侵袭力的影响,探索子宫内膜癌新的治疗方法。方法:1 Ishikawa细胞培养:Ishikawa细胞由河北医科大学第四医院动物中心细胞库提供,培养于含10%FBS的RPMI-1640培养基中,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养至细胞汇合度达50%-60%。2 MTT法检测L-733060对Ishikawa细胞增殖影响:将Ishikawa细胞分为对照组及含不同浓度L-733060(5、10、20、40μM)的实验组。取对数生长的Ishikawa细胞,制成单细胞悬液,将5x10~4个Ishikawa细胞按分组接种于96孔板,作用48h之后,加入MTT,通过酶标仪观察吸光度,计算抑制率,进而判断L-733060对Ishikawa细胞的作用效果及最佳作用浓度。3流式细胞仪检测L-733060对Ishikawa细胞周期及凋亡的影响:将Ishikawa细胞分为对照组及含不同浓度L-733060(5、10、20、40μM)的实验组。药物处理48h。(1)凋亡:经5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色后,通过流式细胞仪分析L-733060对Ishikawa细胞凋亡的影响。(2)周期:用预冷70%乙醇4℃固定12h。Binding Buffer重悬细胞。PI染色后通过流式分析L-733060对Ishikawa细胞周期的影响。4 Transwell小室法检测L-733060对Ishikawa细胞侵袭能力的影响:将Ishikawa细胞分为对照组及含不同浓度L-733060(5、10、20、40μM)的实验组。按分组将经过饥饿处理的Ishikawa细胞接种于Transwell小室(24孔板,8μm孔径,人工基底膜基质1mg/m L)的上室,药物处理48h之后,通过计算透膜细胞数评价L-733060对Ishikawa细胞侵袭的影响。5实验数据应用SPSS13.0软件进行数据处理:数据处理采用单因素方差分析,采用Levene分析进行方差齐性检验。组间差异采用LSD进行两两比较。α=0.05为检验标准,认为P0.05时有统计学意义。统计图的描绘采用Graph Pad Prism 5以及SPSS13.0软件。结果:1应用不同浓度L-733060(5、10、20、40μM)作用48h后MTT测定结果:抑制率分别是10.260±2.746%、22.633±3.050%、61.180±5.346%、91.873±8.905%。组间差异有统计学意义(P0.01)。在5至40μM浓度范围内L-733060能够抑制Ishikawa细胞系的生长,并且伴随着浓度增高这种抑制作用逐渐增强。2不同浓度L-733060(0、5、10、20、40μM)作用48h后流式细胞仪测定结果:各组凋亡百分率分别为4.437%±0.952%、7.767%±1.725%、11.82%±1.350%、19.723%±1.957%、26.39%±2.168%。各组之间差异有统计学意义(P0.01),且L-733060浓度越高,凋亡百分率越高。3不同浓度L-733060(0、5、10、20、40μM)作用48h后测量G0-G1期细胞百分比分别为45.390±0.948%、47.253±1.546%、54.287±1.826%、63.730±1.721%、69.293±1.895%。G2-M期细胞百分比分别为16.323±0.441%、15.593±0.402%、13.160±0.881%、10.637±0.497%、8.183±1.204%。S期细胞百分比分别为38.967±1.670%、37.203±1.491%、32.400±1.213%、25.633±1.245%、22.523±0.725%。L-733060可增加G0-G1期细胞分布,减少S期和G2-M期细胞分布,且随着浓度的增加,G0-G1期细胞比例明显增加,S期和G2-M期细胞比例明显减少,各细胞周期的分布比例具有明显差异(P0.01)。4不同浓度L-733060(0、5、10、20、40μM)作用48h后穿膜细胞数分别为177.333±30.989、152.000±27.875%、94.333%±19.604%、51.000±12.000、10.333±4.163。L-733060作用后穿膜细胞数明显减少,组间差异具有统计学意义(P0.01)。结论:1 L-733060能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖,且在实验浓度范围内,浓度与抑制程度呈线性正相关。表明了NK-1受体拮抗剂可以抑制子宫内膜癌的增殖,为子宫内膜癌的治疗提供新的依据。2 L-733060可以诱导子宫内膜癌细胞的凋亡,且在实验浓度范围内,细胞凋亡百分比与药物浓度呈线性正相关。从细胞周期角度观察,L-733060可以抑制子宫内膜癌细胞进入S期,使细胞停留G0-G1期,抑制细胞分裂,从而引起细胞凋亡。证明了NK-1受体拮抗剂可以通过诱导子宫内膜癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用可能与改变肿瘤细胞周期有关。3 L-733060能够抑制子宫内膜癌细胞的侵袭,药物浓度越大,细胞侵袭能力越低。表明了NK-1受体拮抗剂可能成为抑制子宫内膜癌细胞转移药物。从而为子宫内膜癌尤其是晚期的子宫内膜癌的治疗提供了新的方法。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【图文】：

L-733060对子宫内膜癌细胞的影响

MTT法测量不同浓度L-733060对Ishikawa细胞抑制率的影响

流式细胞仪,细胞凋亡

TT 法测量不同浓度 L-733060 对 Ishikawa 细胞抑制 MTT assay to measure the effects of L-733,060 on Ishproliferation.

式细胞仪测量不同浓度 L-733060 对 Ishikawa 细胞周low cytometry to measure the effects of L-733,060 on c

【参考文献】