脑胶质瘤与基质细胞交互作用的模型设计及机制研究

发布时间：2020-07-08 07:26

【摘要】：研究背景脑胶质瘤(Glioma)是一种起源于脑胶质细胞的颅内原发性恶性肿瘤,根据美国脑肿瘤注册中心(CBTRUS)最新统计结果,胶质瘤占脑肿瘤总数的28%及颅内恶性肿瘤的80%。在我国,虽尚无大规模流行病调查资料,但综合多篇临床资料统计,国内胶质瘤发病率占颅内肿瘤的40%-67%,胶质瘤已成为危害人民群众生命健康的主要颅脑疾病。尽管手术及放化疗等多种治疗手段的联合应用,其预后仍极差。以多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)为例,患者的平均生存期仅为14.6个月。放射治疗联合替莫唑胺(Temozolomide, TMZ)化疗作为手术切除胶质瘤后重要的辅助治疗手段,对延长患者的生存期有一定的作用。然而综合治疗后胶质瘤最终会复发,复发部位往往临近手术切除区域。由于胶质瘤广泛浸润到周围脑组织,这些复发一方面是由于胶质瘤细胞自身可以产生并释放一系列的抑制性因子如IL-10、TGF-β、PGE2等从而参与了胶质瘤的免疫逃逸,另一方面肿瘤细胞与周围基质细胞(Stromal Cell)的相互作用也可能是诱导胶质瘤复发的重要因素。因此,对胶质瘤周围基质细胞进行研究,分析基质细胞在胶质瘤治疗以及复发时与肿瘤细胞的作用机制,将有助于提高胶质瘤的治疗效果,抑制肿瘤复发。胶质瘤周围基质细胞包括胶质细胞,内皮细胞,免疫细胞及神经元细胞等多种细胞,其中胶质细胞分布最广,所占比例最大。星形胶质细胞(Astrocyte)作为胶质细胞的主要组成部分,已经被证实在黑色素瘤和乳腺癌的脑转移瘤中上调肿瘤细胞的生存基因,并提高肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。但对于脑胶质瘤,尚无研究表明星形胶质细胞发挥着同样的促肿瘤生长及耐药的作用。为进一步研究星形胶质细胞的作用,需要建立合理的体外及动物模型。模型除了能够尽可能的模拟胶质瘤发生发展的病理过程外,还应该能够高效快速的将星形胶质细胞与肿瘤细胞分选开来,进而对星形胶质细胞对胶质瘤生长的影响做进一步的机制研究。体外模型是指在生物体外采用细胞或者生物分子来模拟生物体内的生理或病理活动进而对其进行研究所建立的模型。为研究基质细胞耐药性作用而建立体外模型的基本思路是将基质细胞与肿瘤细胞共培养,加入抗肿瘤药物后,对比肿瘤细胞单独培养时肿瘤细胞的生存率,进而得出基质细胞对肿瘤细胞增殖的影响。共培养后,可以在不分离出基质细胞的情况下,检测肿瘤细胞的生存率,也可以将基质细胞从共培养模型中分离出来,分析哪些信号通路或细胞因子的表达有所变化,寻找可能影响肿瘤生存率或抗药性的靶点。目前,已有建立的二维(2-Dimensional,2-D)单层肿瘤细胞与基质细胞的共培养模型。但实体性肿瘤如胶质瘤在体内并不是单层生长,而是呈团块样三维(3-Dimensional,3-D)生长,2-D模型并不能很好的模拟实体性肿瘤的生长方式。动物实验作为连接基础研究与临床治疗之间的桥梁,发挥着极为重要的作用。免疫缺陷裸鼠因其可成功的进行异体移植生成肿瘤而被广泛的应用于肿瘤研究,胶质瘤细胞系或来源于患者术后的胶质瘤原代组织都可以在裸鼠颅内原位种植并形成肿瘤。在近十年中,多种表达荧光的免疫缺陷小鼠品系被培育出来,并被证实可成功的进行多种肿瘤包括胶质瘤的异体移植及细胞分离,这对于研究基质细胞对肿瘤生长、侵袭及耐药的作用具有重要意义。免疫缺陷裸大鼠除了具有免疫缺陷小鼠的特点外,还具有生命周期长,体积大、便于手术操作,以及能提供更多的肿瘤组织进行实验研究等特点,但目前尚无荧光免疫缺陷裸大鼠构建成功的报道。本课题包括两部分,第一部分：构建胶质瘤细胞与星形胶质细胞体外三维共培养模型,并通过萤火虫荧光素检测技术,对三维共培养模型中的胶质瘤细胞活性进行定量检测,分析星形胶质细胞在胶质瘤化疗耐受中的作用及机制；第二部分：构建绿色荧光免疫缺陷裸大鼠动物模型,该模型进行胶质瘤的异体移植后可载瘤生存,并可对肿瘤组织中的胶质瘤细胞和基质细胞进行高效分离。期望通过以上两种模型的建立,能为胶质瘤中基质细胞与肿瘤细胞交互作用的研究提供新的方法和思路。一.构建脑胶质瘤三维共培养模型研究基质细胞介导的化疗抵抗目的构建eGFP-Luc胶质瘤细胞与星形胶质细胞三维共培养体外模型,通过Luciferin荧光检测技术,对三维共培养模型中的胶质瘤细胞活性进行定量检测,分析星形胶质细胞在胶质瘤化疗耐受中的作用及机制。方法1.制作绿色荧光和生物荧光素的慢病毒并转染胶质瘤细胞系用包装质粒psPAX.2,包膜质粒pMD2.G和载体质粒eGFP/Luciferase通过BBS/CaCl2方法转染293FT细胞,转染成功后48小时收集病毒。病毒转染HF66,A172,LN18,U251,C6胶质瘤细胞系及P3胶质瘤原代细胞系。转染成功后,利用流式细胞仪根据增强绿色荧光蛋白(eGFP)的表达分选出表达eGFP和萤火虫荧光素酶(Luciferase)的细胞,进行培养。2.构建脑胶质瘤和星形胶质细胞的三维共培养模型选择96孔V型板,每孔中加入8000个eGFP/Luc胶质瘤细胞和5000个TNC-1星形胶质细胞,按照1.74μg/mL的浓度加入甲基纤维素(Methylcellulose),用培养液调节每孔100μl,室温下756G转速离心15分钟,使细胞沉聚于V型板底部。培养48小时,荧光显微镜下观察三维共培养团块形成。3.生物荧光素法检测三维共培养模型中胶质瘤细胞的增殖①检测生物荧光强度与胶质瘤细胞数目的关系。在96孔板中分别种植不同数目的U251和A172胶质瘤细胞,培养48小时形成三维肿瘤团块。加入D-Luciferin,避光培育30分钟,检测三维肿瘤团块的生物荧光强度。②星形胶质细胞的数目是否影响三维共培养模型的生物荧光强度。8000/孔的A172胶质瘤细胞分别与不同数目的TNC-1细胞共培养48小时,加入D-Luciferin,避光培育30分钟,检测不同TNC-1数目三维共培养团块的生物荧光强度。③加入化疗药物后,生物荧光素法检测三维共培养模型的生物荧光强度。胶质瘤细胞与TNC-1形成三维共培养团块后,分别加入TMZ和阿霉素(Doxurubicin)进行培养。5天后,生物荧光素法检测三维共培养模型的生物荧光强度。4.比较生物荧光素法与MT8法检测三维共培养模型中胶质瘤细胞增殖的准确性①按每孔8000细胞将LN18胶质瘤细胞分别种入两个96孔板,培育2天形成三维肿瘤团块后,加入不同浓度的TMZ。培育5天,分别进行MTS法和生物荧光素检测。检测后收集不同浓度组的肿瘤团块,加入酶消化成单细胞悬液后流式细胞仪计数LN18胶质瘤细胞。②按每孔8000 LN18细胞和5000 TNC-1细胞,种入两个96孔板,培育2天形成肿瘤团块后,加入不同浓度的TMZ。培育5天,分别进行MTS法和生物荧光素法检测。检测后收集不同浓度组的肿瘤团块,加入酶消化成单细胞悬液后流式细胞仪计数表达eGFP的LN18细胞数目。③分别用MTS法和生物荧光素检测法检测U251、A172、C6胶质瘤细胞与TNC-1细胞三维共培养团块中胶质瘤细胞的增殖。5.检测星形胶质细胞调节胶质瘤细胞对化疗药物的抵抗胶质瘤细胞单独或与TNC-1共培养2天,分别形成三维肿瘤团块和三维共培养团块。加入不同浓度的TMZ或阿霉素,培养5天后,生物荧光素法检测三维团块的生物荧光强度。结果1.制作携带增强绿色荧光和生物荧光素基因的慢病毒并转染胶质瘤细胞系同时具有eGFP和Luciferase基因的慢病毒转染不同的胶质瘤细胞系及胶质瘤原代细胞系P3。转染后免疫荧光显微镜下观察胶质瘤细胞表达绿色荧光,确认转染成功后,流式细胞技术分选出高表达绿色荧光的胶质瘤细胞,进行培养。2.构建脑胶质瘤和星形胶质细胞的三维共培养模型荧光显微镜下观察胶质瘤细胞与TNC-1细胞形成的三维共培养模型呈球状,绿色荧光分布均一,模拟了胶质瘤在体内呈三维生长的生物学特性。3.生物荧光素法检测三维共培养模型中胶质瘤细胞的增殖三维共培养模型中,生物荧光素强度与胶质瘤细胞的数目呈正比,基质细胞TNC-1的数目不影响荧光强度。加入化疗药物替莫唑胺和阿霉素培育后,仍可加入D-luciferin进行生物荧光检测,对检测结果无影响。4.检测三维共培养模型中胶质瘤细胞的增殖,生物荧光素法较MTS法更准确生物荧光素法和MTS法的检测数值分别与流式细胞术计数结果相比较,生物荧光素法较MTS法更加灵敏和准确,更能反映三维共培养模型中胶质瘤细胞的增殖情况。5.对于不同的胶质瘤细胞,星形胶质细胞调节胶质瘤细胞化疗抵抗的作用不同TNC-1能增强J251、C6、A172和P3对TMZ的耐受性,促进胶质瘤细胞的增殖,对LN18和HF66无影响。TNC-1能增强U251、LN18和HF66对阿霉素的耐受性,促进胶质瘤细胞的增殖；随阿霉素浓度的增加,能降低A172对阿霉素的耐受性,抑制胶质瘤细胞的增殖；对C6、P3无影响。结论1.生物荧光素法检测三维共培养模型的生物荧光强度与胶质瘤细胞数目成正比。2.三维共培养模型中基质细胞的数目对生物荧光强度的检测无影响。3.三维共培养模型中检测胶质瘤细胞的增殖,生物荧光素法较MTS法更为准确和灵敏。4.TNC-1能增强U251、C6、A172和P3对TMZ的耐受性,对LN18和HF66无影响。5.TNC-1能增强U251、LN18和HF66对阿霉素的耐受性,降低A172对阿霉素的耐受性,对C6、P3无影响。二.构建绿色荧光裸大鼠模型研究肿瘤与基质反应目的构建绿色荧光裸大鼠作为研究肿瘤与基质反应的动物模型,验证绿色荧光裸大鼠可进行肿瘤细胞或组织的异体移植形成肿瘤,并可对肿瘤组织中的肿瘤细胞和基质细胞进行高效分选。方法1.培育能表达绿色荧光的免疫缺陷裸大鼠①表达绿色荧光的SD-TG(GFP)2BalRrrc转基因鼠和HsdHanTM:mu/mu Rowett裸大鼠进行繁殖。子代用PCR进行基因表型检测,杂合的GFP鼠与上一代的HsdHanTM:mu/mu Rowett继续繁殖,获得杂合的表达绿色荧光的裸大鼠。②手术取得绿色荧光裸大鼠的新鲜脑、心脏、肾、肺、肝脏、小肠等器官,紫外线解剖显微镜下观察器官是否表达绿色荧光。RT-PCR定量各器官中绿色荧光蛋白mRNA的表达量。2.比较绿色荧光裸大鼠与和免疫缺陷裸大鼠的免疫表型抽取用于繁殖的两种大鼠以及绿色荧光裸大鼠的外周血,用不同的免疫荧光抗体(CD3, CD19, CD161)结合免疫细胞,流式细胞术检测不同的血液标本中T、B及NK细胞的存在情况。3.验证绿色荧光裸大鼠能否进行肿瘤细胞异体移植①注射表达红色荧光的鼠乳腺癌细胞系dsRed4T1于绿色荧光裸大鼠的乳腺,观察是否有肿瘤形成。②取6位胶质瘤患者的原代肿瘤组织,立体定向种植于绿色荧光裸大鼠的颅内,磁共振扫描观察是否有肿瘤形成。处死大鼠取得脑组织,制作脑组织蜡块,切片后进行HE染色,确认肿瘤的边界。4.分离绿色荧光裸大鼠肿瘤组织中的肿瘤细胞和基质细胞①手术取得绿色荧光裸大鼠的乳腺癌组织,机械切碎后酶解为单细胞悬液。流式细胞仪分选表达红色荧光的乳腺癌细胞和绿色荧光的基质细胞。②手术取得绿色荧光裸大鼠的胶质瘤组织,机械切碎后酶解为单细胞悬液。流式细胞仪分选表达绿色荧光的基质细胞和不表达绿色荧光的肿瘤细胞。用人细胞核(HuNu)特异性抗体对分选前后的细胞进行免疫细胞化学(ICC)染色,确认分选效率。结果1.构建能表达绿色荧光的裸大鼠模型表达绿色荧光的SD-TG(GFP)2BalRrrc转基因鼠和HsdHanTM:rnu/rnu Rowett裸大鼠进行繁殖,得到表达绿色荧光的裸大鼠。裸大鼠的脑、心脏、肾、肺、肝脏、小肠的均表达绿色荧光,RT-PCR表明脑组织表达量最高,心脏表达量最低。2.绿色荧光裸大鼠与免疫缺陷裸大鼠具有相同的免疫表型流式细胞术分析大鼠外周血,绿色荧光裸大鼠和HsdHanTM:rnu/rnu Rowett裸大鼠都缺少T淋巴细胞,但都具有B淋巴细胞和NK细胞。3.绿色荧光裸大鼠可以进行肿瘤细胞的异体移植表达红色荧光的鼠乳腺癌细胞系dsRed4T1原位移植后形成乳腺癌；MRI检测以及取得标本后的HE染色证实6组来源于不同胶质瘤患者的肿瘤原代细胞有5组在绿色荧光裸大鼠颅内形成肿瘤。4.绿色荧光裸大鼠肿瘤组织中的肿瘤细胞和基质细胞可进行高效分离流式细胞术可以高效分选表达红色荧光的4T1乳腺癌细胞、不表达荧光的胶质瘤细胞和表达绿色荧光的基质细胞。结论1.绿色荧光裸大鼠各器官稳定表达绿色荧光蛋白。2.绿色荧光蛋白在脑组织中表达最高,心脏中表达最低。3.绿色荧光裸大鼠与免疫缺陷裸大鼠免疫表型相同,不表达T淋巴细胞。4.鼠乳腺癌细胞和人脑胶质瘤原代组织可在绿色荧光裸大鼠上进行异体原位移植。5.流式细胞术可高效分选绿色荧光裸大鼠肿瘤组织中的肿瘤细胞和基质细胞。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4

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