肾素原受体通过调节上皮间质转化促进乳腺癌MCF-7细胞侵袭和转移

发布时间：2020-07-08 11:56

【摘要】：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,也是全世界最常见的三大恶性肿瘤之一,是导致女性死亡的主要原因。目前,乳腺癌是一全身性疾病已得到共识,早期即可全身转移。尽管治疗手段的进步提高了乳腺癌的生存率,但复发和转移仍是导致乳腺癌患者死亡的重要原因。20%-30%的乳腺癌患者会发生远处转移,并且发生转移后乳腺癌患者中位生存期仅仅只有2年。三阴性乳腺癌(triple-negativebreast cancer,TNBC)即雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2,HER2)均为阴性,通常有更高的组织学分级,并且伴随TP53突变,预后差。由于其受体阴性,不适于内分泌治疗及Her2靶向治疗,临床上主要采取手术联合化疗的方法,但该类乳腺癌患者生存率明显低于其他类型乳腺癌患者。因此为该类患者寻找更加有效的治疗方式尤为重要。肿瘤转移是一个复杂的动态过程,大致可概括为三个过程,即转移起始过程、转移进展过程、转移毒力(致病)过程。上皮间质转化在转移起始和进展过程均有非常重要的作用。在转移起始过程,上皮间质转化使肿瘤细胞失去上皮细胞极性,脱离原发灶,侵入间质,进入血管。在转移进展过程,上皮间质转化支持循环中的肿瘤细胞存活并溢出血管、定居在远处转移器官。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指特定的生理、病理状况下,上皮细胞向间质细胞形态转化,从而增强细胞迁移和运动能力。在机体病理状态下,尤其是肿瘤中,上皮间质转化扮演重要角色。乳腺癌细胞发生EMT后侵袭和转移能力增强。EMT过程重要的分子事件是E-cadherin表达下调,N-cadherin和Vimentin表达上调。因此可通过检测这三个分子来验证是否发生 EMT。肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin-syetem,RAS)是人体体液调节系统的重要组成部分。RAS系统包含着多种多肽、酶、及受体,调节人体血压、水和电解质平稳。越来越多的研究发现除了调节人体水和电解质平衡以及血压平稳外,RAS系统与细胞增生、凋亡、炎症、血管新生、肿瘤发生密切相关。肾素原(prorenin)、肾素(renin)及其受体肾素(原)受体((pro)reninreceptor,PRR)是RAS系统重要组成部分,有越来越多的证据表明PRR与肿瘤的发生和血管新生有着密切联系。PRR是由350个氨基酸组成的跨膜区域蛋白,由Nguyen等发现和成功克隆,其编码基因叫做ATP6ap2/PRR,位于人X染色体上(Xp11.4)。它通过与肾素和肾素原结合而发挥生理和病理作用。有文献报道PRR在乳腺癌组织及细胞中高表达,并且阻断(P)RR,乳腺癌细胞生长也受到抑制,但是具体机制不详。因此,我们设想PRR能否促进乳腺癌细胞的增殖,并通过影响EMT促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。目的:检测PRR对乳腺癌MCF-7细胞的侵袭和转移能力的影响以及与EMT的关系。方法:1.采用免疫组化检测PRR在乳腺癌组织和癌旁组织是否有表达差异。采用免疫荧光法检测乳腺癌组织,明确PRR的定位。2.分别以 human-PRR-siRNA 和 negatlive control-siRNA 转染 MCF-7 细胞株。然后以Westem blot,PCR法检测PRR,根据PRR表达情况不同,将乳腺癌细胞株分成实验组和对照组。实验组(MCF-7-PRR-si):PRR被SiRNA沉默的乳腺癌MCF-7细胞;对照组(MCF-7-NC):未沉默PRR的乳腺癌MCF-7细胞。3.CCK-8实验检测MCF-7细胞增殖能力。4.Transwe实验检测MCF-7细胞侵袭和转移能力。5.Westem blot,PCR 法检测 EMT 标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)蛋白和mRNA表达情况。6.免疫组化检测β-catenin在乳腺癌组织和癌旁组织的表达。结果:1.免疫组化表明PRR在癌组织和癌旁组织均有表达。但在癌组织中的表达比癌旁组织明显增高;进一步的免疫荧光表明PRR主要表达于乳腺癌细胞而不是间质。2.CCK-8实验示相同时间和条件下,实验组(MCF-7-PRR-si)OD值要小于对照组(MCF-7-NC)OD值,提示实验组(MCF-7-PRR-si)细胞生长速度慢。3.Transwell侵袭结果示实验组(MCF-7-PRR-si)穿出小室的MCF-7细胞细胞数显著低于对照组(MCF-7-NC)(p0.05)。transwell迁移实验示,实验组(MCF-7-PRR-si)迁移到下室的细胞数目少于对照组(MCF-7-NC)(p0.05),提示对照组MCF-7细胞侵袭和迁移能力强。4.Western blot检测示:实验组(MCF-7-PRR-si)E-cadherin蛋白表达高于对照组(MCF-7-NC),而 N-cadherin、Vimentin 表达低于对照组(MCF-7-NC)。PCR示:实验组E-cadherin mRNA表达高于对照组(MCF-7-NC),而N-cadherin和Vimentin mRNA表达低于对照组(MCF-7-NC)。5.免疫组化显示β-catenin在癌组织表达高于癌旁组织。结论:PRR可通过调节EMT促进乳腺癌MCF-7细胞株的侵袭和转移。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

乳腺浸润性导管癌,癌组织

定目标分子的定性及相对定量分析。免疫组化显示ＰＲＲ在正常乳腺导管上皮和逡逑乳腺浸润性导管癌组织均有表达，但在乳腺浸润性导管癌中的表达水平明显高逡逑于癌旁（图１）。为进一步确定ＰＲＲ在乳腺浸润性导管癌组织的表达部位，对乳逡逑腺浸润性导管癌组织的石蜡切片进行免疫荧光实验，对ＰＲＲ和ＣＤ３１邋（血管内逡逑皮标志物）进行荧光共定位分析（图２），显示ＰＲＲ邋（绿色）主要在乳腺癌细胞逡逑表达，而在间质不表达。（图２中ＣＤ３１显示为红色，ＰＲＲ显示为绿色，蓝色显逡逑示细胞核）逡逑癌旁逦浸润性lY管癌逡逑图１ＰＲＲ在乳腺浸润性导管癌癌组织和癌旁组织的表达（Ｘ邋１00）逡逑Ｆｉｇｌ邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＲＲ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｉｎｖａｓｉｖｅ邋ｄｕｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ａｎｄ逡逑ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｔｉｓｓｕｅ邋（邋Ｘ邋ｌ00）邋．邋（ｓｃａｌｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓ

导管癌,细胞,乳腺癌,实验组

图３乳腺浸润型导管癌组织和癌旁组织ＨＥ染色（Ｘ４０）逡逑Ｆｉｇ３邋Ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＨＥ邋ｉｎ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｉｎｖａｓｉｖｅ邋ｄｕｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋（邋Ｘ逡逑４０）邋．（ｓｃａｌｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｌＯＯｕｍ）逡逑２邋ＰＲＲ沉默结果逡逑分别以邋ｈｕｍａｎ－ＰＲＲ－ｓｉＲＮＡ邋和邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ邋转染邋ＭＣＦ－７邋细胞，再以邋Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ和ＲＴ－ＰＣＲ分别检测ＭＣＦ－７细胞ＰＲＲ蛋白及ｍＲＮＡ，确定ＰＲＲ在乳腺癌ＭＣＦ－７细胞逡逑中的沉默结果。然后根据ＰＲＲ情况将ＭＣＦ－７细胞分为实验组和对照组。图４Ａ为乳腺癌逡逑ＭＣＦ－７邋细胞以邋ｈｕｍａｎ－ＰＲＲ－ｓｉＲＮＡ邋和邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ邋处理后邋ＰＲＲ邋蛋白的邋Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ结果。显示为实验组ＰＲＲ蛋白表达较对照组降低；图４Ｂ进一步表示经过逡逑ｈｕｍａｎ－ＰＲＲ－ｓｉＲＮＡ处理后，实验组ＰＲＲ明显下降（ｐ＜０邋．邋０５邋）；图４Ｃ为经过逡逑ｈｕｍａｎ－ＰＲＲ－ｓｉＲＮＡ邋和邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ邋转染乳腺癌邋ＭＣＦ－７邋细胞后，ＰＲＲｍＲＮＡ邋表达逡逑情况。可看出：实验组ＰＲＲｍＲＮＡ较对照组明显下降（Ｐ＜０．邋００１）。转染成功后为进行后逡逑续细胞实验做准备。逡逑

曲线,乳腺癌,实验组,对照组

通过使用酶标仪在４５０ｎｍ波长处测定ＯＤ值来反映活细胞数量。逡逑在相同条件下，分别在２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ对实验组（ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ）和对照逡逑组（ＭＣＦ－７－ＮＣ）在４５０ｎｍ处测定０Ｄ值，如图５所示，红色曲线代表实验组逡逑（ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ），蓝色曲线代表对照组（ＭＣＦ－７－ＮＣ）。在７２ｈ时，实验组逡逑（ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ）邋０Ｄ邋值为邋１．７１４±０．３０９，而对照组（ＭＣＦ－７－ＮＣ）邋０Ｄ邋值为逡逑２．８９６±０．２６４。实验组０Ｄ值明显小于对照组，即实验组细胞数少于对照组细胞逡逑数，差异具有统计学意义（ｔ＝－５．０４２，Ｐ＜０．０１）。从而说明实验组（ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ）逡逑细胞增生能力明显下降。因此，ＰＲＲ可显著促进乳腺癌ＭＣＦ－７细胞的增殖。逡逑ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ逡逑４￣｜逦ＭＣＦ－７－ＮＣ逡逑ｉｒｋ逡逑丨：：ｙ逡逑ＵＴ１Ｉ１Ｉ１Ｉ１Ｉ逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逡逑Ｔｉｍｅｓ（ｈｏｕｒｓ）逡逑图５邋ＰＲＲ调节乳腺癌ＭＣＦ－７细胞的增殖逡逑Ｆｉｇ５邋ＰＲＲ邋ｍｏｄｕｌａｔｅｓ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｃａｎｃｅｒ邋ＭＣＦ－７邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｙ邋ＣＣＫ８邋ａｓｓａｙ逡逑２６逡逑

【参考文献】