外泌体miR-204-5p抑制结直肠癌细胞增殖的实验研究

发布时间：2020-07-11 14:11

【摘要】：目的:构建过表达抑癌基因miR-204-5p的HEK-293T(293T)稳转株,并收集其富含miR-204-5p的外泌体(exosome),在体内外水平验证外泌体miR-204-5p对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞增殖和凋亡的作用,为CRC的治疗提供新思路。方法:构建miR-204-5p过表达的质粒pWPXL-miR-204,通过慢病毒包装构建HEK-293T稳转株293T-pWPXL-GFP(293T-GFP)、293T-pWPXL-miR-204(293T-miR-204);采用荧光实时定量PCR验证miR-204-5p在稳转株细胞293T-miR-204,及其外泌体中的表达;采用荧光实时定量PCR验证CRC细胞LoVo、HCT116分别与HCT116-pWPXL-miR-204(HCT116-miR-204),293T-miR-204培液上清的条件培养基和外泌体共培养后的miR-204-5p表达水平;将CRC细胞分别与293T-miR-204、293T-GFP培液上清的条件培养基和外泌体共培养,再采用CCK-8法和克隆形成实验检测CRC细胞的增殖能力,用流式细胞仪检测CRC细胞的凋亡情况,用蛋白质印迹法(Western Blot)检测CRC细胞中miR-204-5p靶基因RAB22A和BCL2的表达;并用CCK-8法检测与293T-miR-204的外泌体共培养后的乳腺癌细胞MDA-MB-231(MDB-231)、MCF-7,胃癌细胞SGC7901,肺癌细胞A549,脑胶质瘤细胞U251的增殖能力;裸鼠成瘤实验比较外泌体miR-204-5p对CRC移植瘤生长的抑制效应;免疫组化方法检测裸鼠肿瘤组织中RAB22A和BCL2的表达。结果:(1)成功建立重组质粒pWPXL-miR-204,并构建293T稳定过表达miR-204-5p的细胞株293T-miR-204;与对照组293T-GFP相比,293T-miR-204细胞和外泌体中miR-204-5p的表达分别上调(2303.79±143.31)倍、(282.33±18.25)倍(P均0.001);(2)CRC细胞LoVo、HCT116与HCT116-miR-204细胞的培液上清共培养后细胞中miR-204-5p分别上调(253.88±9.21)倍、(275.78±9.58)倍,与293T-miR-204培液上清的条件培养基共培养后细胞中miR-204-5p分别上调(283.37±16.81)倍、(338.09±24.31)倍,与HCT116-miR-204的外泌体共培养后上调(31.01±1.60)倍、(29.44±2.93)倍,与293T-miR-204的外泌体共培养后上调(30.89±4.65)倍、(41.97±6.23)(P均0.001);(3)CCK-8实验和克隆形成实验证明与293T-miR-204培液上清的条件培养基和外泌体共培养可抑制CRC细胞的增殖;(4)CCK-8实验证明293T-miR-204细胞的外泌体可抑制MDB-231和MCF-7、SGC7901、A549、U251细胞的增殖;(5)流式细胞仪检测发现与293T-miR-204培液上清的条件培养基和外泌体可促进CRC细胞的凋亡;(6)Western Blot实验发现与293T-miR-204培液上清的条件培养基和外泌体共培养后,CRC细胞中miR-204-5p的下游靶基因RAB22A和BCL2的表达下调;(7)裸鼠成瘤实验证明外泌体miR-204-5p可抑制CRC移植瘤的生长;(8)免疫组化实验验证外泌体miR-204-5p可下调移植瘤肿瘤组织中RAB22A、BCL2的表达。结论:(1)成功构建稳定过表达miR-204-5p的细胞293T-miR-204,且miR-204-5p可被富集包装入293T-miR-204细胞的外泌体中;(2)外泌体miR-204-5p可进入CRC细胞并通过下调RAB22A、BCL2抑制其增殖,促进细胞凋亡。以上实验结果为外泌体作为抑癌基因miR-204-5p的载体用于CRC的治疗提供了新的思路。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.3
【图文】：

江南大学硕士学位论文腔内堆积。存在于早期内涵体中的分子可以被回收整合到质膜上S 中[29]。内容物分拣到 ILVS 的机制是由依赖于内涵体分选转运dosomal sorting complexes required for transport dependent，ESCR早期内涵体向内出芽的方式堆积在晚期内涵体，从而将内涵体转esicular bodies，MVBs）[33]。随后这些 MVBs 与溶酶体融合后被释放其内部囊泡，如外泌体。重要的是，MVBs 的转运和与细胞ab 鸟苷三磷酸酶（GTPase）蛋白调控，并与细胞骨架和分子运动

图 1-2 外泌体的生物合成与内化机制，以及它在生理病理状态发挥的作用ig. 1-2 Exosomal biogenesis and internalization mechanisms and their roles in physiological pathological processes.（2）分离与鉴定外泌体的分离纯化主要基于免疫亲和捕获、聚合物沉淀、超速离心和微流控技技术原理并不是相互排斥的，它们的组合使用或许更有助于高效分离纯化外这些分离方法，国际细胞外囊泡学会提出的标准化程序可以提供详细的指导[止，其中采用最为广泛和最可靠的方法是超速离心，它包括一系列的离心步种方法繁琐耗时，需要大量的生物样品量。因此，商用聚合物沉淀试剂盒用于外泌体的分离[41]。这些方法采用 ExoQuick 和 TotalExosome 等分离试剂，耗时短，但产品纯度低于超速离心法。目前仍旧无法完全分离或消除尺寸接近的不同类型 EVs，这表明外泌体的提一些小的 EVs 或其他成分，而非“纯”的外泌体。免疫亲和分离法可能会富的外泌体群体[42]，但这种方法的产量无法得到保证。最近，Heller 等人用交[43]。该装置只需 30~50

第一章 绪论靶细胞，从而对其靶点 mRNA 的功能进行调节。然而，由于缺乏对 EV 介导的 miRNA转移功能的直接论证，因此该假设中包含不确定性。这一假说的核心是原始转录本加工成能在受体细胞中直接发挥作用的活性 miRNAs 的过程只发生在哺乳动物细胞内。然而，这一观点正面临一些挑战。已有研究发现，miRNA 加工的关键成分 Dicer 和 Ago 2在外泌体中存在并可发挥功能[58]。虽然尚未证实，但这些发现表明，外泌体不仅是miRNA 被动的载体，也可能是它的加工工厂。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张慧敏;包含;付蓉;刘丹;刘美娜;;医院结直肠癌治疗质量评价指标体系的建立[J];中国医院统计;2015年01期

2 李赛莲;许保;陈正义;黄晓曦;陈建强;;结直肠癌患者微小RNA-335表达及临床意义[J];中国老年学杂志;2019年20期

3 史韦韦;徐甫保;;对结直肠癌患者进行腹腔镜手术的效果评价[J];当代医药论丛;2019年18期

4 ;中国结直肠癌县域医师诊疗指南-外科部分（2019版草案）[J];中华结直肠疾病电子杂志;2019年05期

5 陶杰夫;;“吃货”需注意的癌症——结直肠癌[J];消费者报道;2015年05期

6 ;饮食组合疗法或对结直肠癌有效[J];中老年保健;2019年07期

7 申燕;;浙江省结直肠癌临床病理、预后调查分析[J];中国地方病防治杂志;2018年06期

8 易礼智;程征宇;王琴;徐辉;;泛素化特异性蛋白酶18在结直肠癌中的表达及其临床意义[J];西南军医;2018年06期

9 孙燕;顾晋;汪建平;;中国结直肠癌诊疗规范(2017年版)[J];上海医学;2018年08期

10 吴凡;;结直肠癌早期诊断研究进展[J];临床医药文献电子杂志;2018年A3期

相关会议论文 前10条

1 夏文杰;邱福铭;黄建;;白介素-8与结直肠癌预后、临床特点相关性荟萃分析[A];浙江省免疫学会第十次学术大会论文集[C];2016年

2 王晓学;汪建平;饶本强;邓丽;黄缘;曾广正;陈诚;;结直肠癌患者和健康人群粪便菌群及代谢产物的差异性研究[A];第十八届中国中西医结合学会大肠肛门病专业委员会学术会议暨甘肃省第五届结直肠肛门外科学术年会论文汇编[C];2015年

3 阮锦成;崔q辉;卜贺启;吴霜;蔡珂;潘海强;沈锋;;结直肠癌淋巴结转移相关因素的研究进展[A];第十八届中国中西医结合学会大肠肛门病专业委员会学术会议暨甘肃省第五届结直肠肛门外科学术年会论文汇编[C];2015年

4 练睿;;以急性症状首发的青年结直肠癌患者三例临床分析[A];中华医学会急诊医学分会第17次全国急诊医学学术年会论文集[C];2014年

5 陈智飞;李一权;孙丽丽;胡宁宁;周晔;李霄;金宁一;;双特异性溶瘤腺病毒对结直肠癌的体内外抑制研究[A];第九届全国免疫学学术大会论文集[C];2014年

6 何超;劳伟峰;;结直肠癌外科治疗进展[A];2009年浙江省肿瘤外科学术年会暨肿瘤外科规范化诊治学习班论文汇编[C];2009年

7 何超;朱洪波;;结直肠癌的生物治疗[A];2009年浙江省肿瘤外科学术年会暨肿瘤外科规范化诊治学习班论文汇编[C];2009年

8 万德森;;进一步提高结直肠癌疗效的思考[A];2009年浙江省肿瘤学术年会暨肿瘤诊治新进展学习班论文汇编[C];2009年

9 王哲海;;结直肠癌的诊断与系统性化疗[A];山东省第四届“CSCO——山东”首届肿瘤化疗学习班论文汇编[C];2009年

10 邓小梅;郑桂喜;王传新;张建;李伟;张晓;;结直肠癌患者血清蛋白质谱检测的意义[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 本报记者 陶婷婷;经常肚子痛、腹泻？小心结直肠癌紧随此顽症来临[N];上海科技报;2019年

2 本报记者 张思玮;居家筛查为结直肠癌防治“提速”[N];中国科学报;2019年

3 本报记者 张思玮;结直肠癌诊治还须“早”发力[N];中国科学报;2018年

4 刘洋 整理;远离结直肠癌 从改变生活方式开始[N];健康报;2019年

5 健康时报融媒体报道团 李桂兰 吕霖 刘玫妍 毛圆圆 董颖钰 杨妙霞 整理;调查:中国首个大规模结直肠癌患者生存调查[N];健康时报;2019年

6 邱成刚;结直肠癌患者坚持健身或能缓解病情[N];中国科学报;2019年

7 本报记者 杨柳;关注结直肠癌——莫让“出路”受阻[N];中国医药报;2018年

8 记者 孙国根 王潇雨;抗结直肠癌新药自主研发成功[N];健康报;2018年

9 特约记者 袁蕙芸;共生梭菌检测有望早诊结直肠癌[N];健康报;2018年

10 张建新;结直肠癌趋向规范化综合诊疗新模式[N];人民政协报;2018年

相关博士学位论文 前10条

1 李晓萌;组蛋白去甲基化酶JMJD1A和染色质重塑蛋白ATRX在结直肠癌中的共同作用探讨[D];吉林大学;2019年

2 刘彤;PCAF与结直肠癌对5-氟尿嘧啶敏感性关系的研究[D];吉林大学;2019年

3 杨帆;APOBEC突变标签在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制研究[D];中国人民解放军海军军医大学;2019年

4 康争春;基于深度测序结直肠癌早期进化分子特征研究[D];中国人民解放军海军军医大学;2019年

5 彭洪;miR-31-5p通过靶向NUMB调控Notch信号通路促进结直肠癌增殖、迁移及侵袭[D];重庆医科大学;2019年

6 朱s

本文编号：2750510