前列腺癌细胞骨转移所致病理性成骨分化的细胞力学生物学研究

发布时间：2020-07-11 15:32

【摘要】：目的:通过向体外条件培养液培养成骨前体细胞施加力学载荷,建立前列腺癌骨转移的细胞力学生物学模型;筛选出前列腺癌骨转移导致病理性成骨分化细胞的差异表达mRNA和miRNA(微小RNA);筛选预测病理性成骨分化相关的信号分子和信号通路;预测防控前列腺癌骨转移所致病理性成骨分化或骨形成的分子靶标,探讨前列腺癌骨转移所致病理性成骨分化的机理。方法:1.以前列腺癌PC-3细胞条件培养液培养小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1,同时采用四点弯曲加载装置向以上成骨前体细胞施加2500με的周期性力学载荷,作为细胞病理性成骨分化组(病理组);向未经条件培养液处理的成骨前体细胞施加2500με的周期性载荷,作为细胞生理性成骨分化组(生理组)。2.检测相关成骨分化指标,建立前列腺癌骨转移所致病理性成骨分化的细胞模型。3.采用高通量测序技术,筛选病理性和生理性成骨分化状态细胞的差异表达miRNA,并以qRT-PCR(实时荧光定量PCR)验证。4.采用数字基因表达谱测序,筛选生理组和病理组差异表达mRNA,采用基因聚类分析、GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,筛选与前列腺癌骨转移细胞所致病理性成骨分化相关的基因以及关键信号途径,预测与病理性成骨相关的分子靶点和信号途径。结果:1.相对于生理组,病理组的碱性磷酸酶活性和染色、成骨分化相关基因/蛋白(Runx 2(Runt-相关蛋白-2)、I型胶原、骨钙素)表达量均下调(*P0.05)。2.采用高通量测序技术,筛选出51个差异表达的miRNA;q RT-PCR验证其中差异显著的24个miRNA,发现7个miRNAs上调,12个miRNAs下调,且qRT-PCR与测序筛选结果相符。3.采用基因聚类分析、GO数据库分析和KEGG Pathway分析,筛选出可能与前列腺癌骨转移所致病理性成骨分化相关的基因以及关键信号途径。结论:成骨细胞在生理力学载荷下,PC-3条件培养液培养抑制成骨细胞的成骨分化,建立了前列腺癌骨转移的细胞力学生物学模型;在此模型基础上,筛选并验证7个上调、12个miRNAs下调的miRNA,筛选出WNT、MAPK、TNF等8条信号途径及相关基因、miRNA很可能与前列腺癌骨转移导致病理性成骨分化相关。
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25
【图文】：

四点弯曲,加载,加载装置,承受力

四点弯曲力学加载装置；B：装置简图：加载时，细胞 Four-point bending device for application of mechanical B:Device diagram: cell tension during loading培养单元的消毒胶对培养空间和加载板子进行黏合处理，确中不出现培养基泄漏；硅橡胶处理过的加载H 溶液过夜浸泡；清水清洗、晾干，接着使取出晾干，再使用清水过夜浸泡，捞出、晾酒精小心擦拭以后，放入超净工作台，打开干加载板孔。细胞种板

成骨细胞培养

图 2A MC3T3-E1 成骨细胞培养（10 X）图 2B PC-3 细胞培养（10 X）Figure 2A Culture of MC3T3-E1(10 X） Figure 2B Culture of PC-3 (10 X）2.2 成骨细胞分化相关指标检测分别采用市售试剂盒，检测碱性磷酸酶活性和染色；荧光定量 PCR检测或免疫印迹法检测成骨分化相关 mRNA/蛋白（Runx-2、I 型胶原、骨钙素）；茜素红染色细胞外基质的钙质沉积。2.2.1 力学刺激下条件培养的成骨前体细胞 ALP 检测细胞以适当密度接种于加载孔中，待细胞完全融合后，分别给细胞施加周期性力学载荷，病理组同时用 PC-3 条件培养基培养，每天予以更换培养液。加载第三天后，检测各组细胞碱性磷酸酶表达差异，如图3，病理组较生理组碱性磷酸酶活性明显减少。

细胞培养

【参考文献】