血液肿瘤中可变剪接的表观遗传调控机制研究

发布时间：2020-07-11 16:52

【摘要】：真核生物的基因表达调控不仅包括转录层面上的调控,同时也包含转录后对前体mRNA的加工过程,转录后调控决定着细胞的命运。RNA的可变剪接是转录后调控的重要机制,随着测序技术的发展,如何从测序后得到的大规模生物学数据和公众组学数据资源中,筛选出具有生物学特征和规律的数据集,深入挖掘可变剪接调控与疾病之间的关系已经成为后基因组时代亟待研究的前沿问题。近年研究表明,可变剪接是共转录剪接过程,不仅受到RNA结合剪接因子的调控,而且表观遗传调控元件,例如染色质结构、核小体密度和组蛋白修饰等也参与可变剪接的过程。异常的可变剪接会造成细胞异常分化和生理功能失调,促使包括癌症在内的多种疾病发生。本论文主要针对表观遗传修饰H3K79me2在人类多种组织的正常和疾病细胞进行可变剪接位点富集度研究,内容包括以下几方面:首先,利用高通量测序技术和已有的开源性数据资源,创建34种人类不同组织正常和疾病细胞H3K79me2的ChIP-seq和RNA-seq数据集。借助计算机模拟技术,分别对数据集进行H3K79me2的富集峰分析和可变剪接事件分析。根据计算出的ψ-value,分别创建五种可变剪接模型。整合数据集分析结果,阐述H3K79me2在不同可变剪接模型的可变剪接位点区域富集特征。我们发现H3K79me2富集水平较高的两个可变剪接类型,即外显子跳读事件和3’端可变剪接事件。从ψ-value的分布特征将细胞层级聚类后初步发现,癌症细胞,包括恶性血液疾病细胞,与正常细胞的图谱具有显著性差异。初步推测,H3K79me2通过对可变剪接调控在癌症的发生发展中起到重要作用。其次,以发现的五种可变剪接模式中占主导位置的外显子跳读事件为研究对象,通过自组织映射神经网络,按照H3K79me2富集特征将34种人类细胞聚类,进一步阐述外显子跳读事件与细胞特异性之间的关系。我们发现两种聚类类群,其中一种聚类主要包含髓系白血病细胞系,特别是MLL-r急性髓系白血病细胞。另一种聚类包括大多数淋巴细胞白血病类型细胞。并且根据千碱基H3K79me2富集的读长数检测和与非可变剪接位点富集程度对比,发现在第一种聚类中,H3K79me2在可变剪接位点区域富集的读长数最多,富集水平最高。我们的研究结果首次从全基因组水平角度揭示H3K79me2在MLL-r急性髓系血病细胞中富集度较高的原因,即外显子跳读剪接是连接表观遗传修饰H3K79me2和MLL-r急性髓系白血病之间的重要纽带。之后,为了从基因表达水平说明H3K79me2对可变剪接的调控机制,分别对外显子跳读事件位点相关基因和随机选择的一系列非外显子跳读事件位点基因进行基因表达水平和富集通路分析。从基因水平分析结果中,可变剪接组和对照组基因表达水平并未发现具有显著性差异,说明H3K79me2的富集程度对可变剪接的调控并不会影响整体mRNA的表达量。通路富集分析进一步揭示H3K79me2调控的外显子跳读事件相关基因在MLL-r急性髓系白血病和慢性髓系白血病细胞中,参与着血液癌症恶化的生物学过程。此外,我们还筛选出调控外显子跳读事件的关键结合蛋白和剪接因子,绘制剪接因子结合图谱,从结合图谱上发现已报道的两个与MLL-r急性髓系白血病关系密切的剪接因子SRSF2和U2AF2更倾向于结合在跳读外显子结束区域。最后,对六种血液细胞中的多个外显子跳读位点进行分子生物学验证,实验中得到的外显子跳读位点与预期结果吻合,并具有高度的细胞/疾病特异性。进一步通过抑制H3组蛋白79位赖氨酸的唯一甲基转移酶DOT1L基因表达,可以显著降低外显子跳读事件相关区域的H3K79me2的修饰水平,导致外显子跳读事件降低或消失,剪接优势异构体从外显子跳读异构体转变为组成型剪接异构体。而本文中发现的DOT1L对MLL-r重排髓系白血病亚型效果显著,H3K79me2水平的降低逆转了AML-MLL-r细胞中的特异性可变剪接。同时白血病AML-MLL-r细胞亚型的细胞增殖受到限制,证实了特异性的可变剪接与细胞增殖密切相关,也阐明了表观遗传标记H3K79me2参与外显子跳读过程的调控对白血病MLL-AML亚型的重要作用,为靶向DOT1L抑制剂的临床患者亚型分类提供应用线索。本论文的研究首次从全基因组水平揭示H3K79me2通过共转录剪接机制,在疾病,特别是恶性血液疾病的发生发展过程中的功能性调控作用。阐述表观遗传修饰、外显子跳读可变剪接事件、关键性剪接因子和恶性白血病的调控关系,梳理出表观遗传调控—分子生物学机制—疾病的发生发展之间的调控主线。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733
【图文】：

示意图,流程,示意图,测序

图 1-1 ChIP-seq 流程示意图Figure 1-1 Process of ChIP-seq围绕 ChIP-seq 技术基本原理，逐渐更新发展着分辨率更高或者用途更为广泛的实验学手段。Chen 等在进行 ChIP-exo 实验后分析大数据后，发现转录因子如何寻找以及如何聚集到同源 DNA 靶点位置[43]。由于 ChIP-seq 技术对抗体的要求较高，抗体的特异性会直接影响测序结果的有效性和分析阶段背景信号的强弱。针对大部分商用抗体会导致测序数据不符合计算机识别标准，形成过多的杂峰问题。Savic 等结合 CRISPR 技术，在抗体质量问题上对 ChIP-seq 技术进行改进，并将改进后的新技术命名为 CETCh-seq[44]。Steube 等利用高强度的紫外线激光照射活细胞后进行免疫共沉淀测序（UV-ChIP-seq）实验学技术，在全基因组水平上发现人类弥漫性大B细胞淋巴癌的特异性转录抑制子BCL6，以及其精确的蛋白质与 DNA 结合特征，并且在通过计算机软件对测序结果的预测分析中，挖掘出 BCL6 在染色质难以探测处的结合位点，这些结合位点是以前从

长度检测,带测量,电泳仪,微流体

图 2-2 微流体电泳仪对 DNA 文库长度检测Figure 2-2 ChIP-DNA library size detection by bioanalyzer其中上方左侧图为电泳条带测量结果，Marker 为标准梯度，条带下方数字1、2 对应右侧峰图中的 LNCap_1 和 LNCap_2 样品，所代表的分别为 LNCap 细胞经过染色质免疫共沉淀后得到的 DNA 文库的两组平行样品，同理数字 3，4为 MV-4-11 细胞的 H3K79me2 组蛋白修饰 ChIP 后的 DNA 文库平行样品。从电泳片段条带上看，所有样品的电泳条带都集中在 300 bp 附近，位于我们的期望条带区域。峰图可以清晰看到，绝大部分的条带在 300 bp 上下位置形成峰顶。LNCap_1 组文库 DNA 样品，有 97%的峰位于 200 bp 到 1000 bp 之间，平均条带为 313 bp，峰值最高点 294 bp；其平行样品 LNCap_2 样品，95%在 200 bp 到1000 bp，平均条带为 328 bp，峰值最高 304 bp，平行测序样品 DNA 片段大小之间无显著性差异。同样，MV-4-11 细胞构建的文库，两组分别有 92%和 91%的峰位于 200bp到 1000bp范围内，MV-4-11_1 文库的平均片段大小为 307bp，最

示意图,可变剪接,事件,代码

代码分别如下：index_gff --index /home/reference/Shg19/indexed_SE_events/ ； index_gff --index /home9.gff3 /data/SE_hg19/indexed_MXE_events/ ； index_gff --in/RI.hg19.gff3 /data/SE_hg19/indexed_RI_events/；index_gff --in/A3SS.hg19.gff3 /data/SE_hg19/indexed_A3SS_events/；indexerence/A5SS.hg19.gff3 /data/SE_hg19/indexed_A5SS_events/。，根据参考注释建立的索引文件，在 linux 操作环境下运行入：miso --run /data/SE_hg19/indexed_SE_events/ LNCaP_R /data/MISO/miso_LNCaP_SE --read-len 51 -p 30。其中，--o文件夹；--read-len 表示测序读长的长度；-p 30 即使用的 C，提炼重要信息，得到样本的统计概要。代码为：summare-samples /data/MISO/miso_LNCaP_SE/ /data/MISO/summaries_

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