VEGFR2抑制剂阿帕替尼调控甲状腺乳头状癌凋亡及自噬的机制研究
发布时间：2020-07-11 18:32
【摘要】：研究目的:1、研究VEGFR2抑制剂阿帕替尼对人甲状腺乳头状癌细胞生长的影响。2、通过体外实验和BALB/c免疫缺陷小鼠甲状腺乳头状癌移植瘤模型体内实验研究阿帕替尼对甲状腺乳头状癌的治疗作用及其机制。3、探索自噬在阿帕替尼处理甲状腺癌细胞中的作用以及机制,以及自噬抑制剂与阿帕替尼联合应用对甲状腺乳头状细胞癌生长的影响及其机制。研究方法:1、应用免疫组织化学染色方法检测甲状腺乳头状癌患者组织中VEGFR2的表达水平及与临床相关性。采用q-PCR及Western-blot方法检测甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织及正常组织中VEGFR2 mRNA及蛋白表达水平,以及不同甲状腺细胞系中VEGFR mRNA及蛋白表达水平。2、通过CCK-8法检测不同浓度及不同作用时间阿帕替尼对甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1增殖的影响。利用划痕实验及Transwell实验检测阿帕替尼对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。应用Annexin V/PI双染法检测阿帕替尼对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的影响,应用PI染色法检测阿帕替尼对细胞周期的影响;并采用Western-blot法检测阿帕替尼处理后K-1及KTC-1细胞中PI3K/Akt信号通路蛋白及周期与凋亡相关蛋白水平的变化。3、通过建立BALB/c免疫缺陷小鼠甲状腺乳头状癌移植瘤模型,检测阿帕替尼对甲状腺乳头状癌的体内作用。4、采用免疫荧光法检测经阿帕替尼处理后甲状腺癌细胞自噬标志蛋白LC3B的表达情况,通过透射电镜观察阿帕替尼处理后甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1细胞胞浆中自噬小体形成情况;阿帕替尼联合自噬抑制剂氯喹(HCQ)处理细胞后采用Western-blot方法检测自噬标志蛋白LC3B的表达水平。5、应用自噬抑制剂3-MA联合阿帕替尼处理细胞后,通过免疫荧光法检测胞浆中LC3B的表达情况,应用透射电镜观察自噬小体形成情况,明确甲状腺乳头状癌细胞自噬水平,并采用Annexin V/PI双染法检测阿帕替尼与3-MA联合应用对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的影响;过Western-blot法检测自噬相关蛋白及凋亡蛋白的表达水平。6、通过转染小干扰RNA ATG5下调自噬相关基因ATG5的表达,再次应用DMSO及阿帕替尼处理两组细胞,并应用Western-blot法检测自噬相关蛋白及凋亡蛋白的表达水平。结果:1、甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织中的VEGFR2的表达水平明显高于癌旁正常组织,且VEGFR2的表达水平与肿瘤大小、癌灶个数及淋巴结转移相关。甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1 VEGFR2的mRNA及蛋白表达水平明显高于正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy Ori3-1。2、以甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1为研究对象,CCK-8结果显示阿帕替尼对于K-1及KTC-1均有抑制增殖的作用,且呈浓度及时间依赖性。划痕实验及Transwell实验结果显示阿帕替尼可以抑制K-1及KTC-1的迁徙和侵袭。克隆形成实验结果显示阿帕替尼可以抑制K-1及KTC-1的克隆形成能力,并呈浓度依赖性。通过AnnexinV/PI双染法检测实验表明阿帕替尼可诱导细胞出现凋亡及G0/G1期周期阻滞,并呈浓度依赖性。Western-blot显示在蛋白水平,阿帕替尼可导致Akt磷酸化水平下降,同时凋亡蛋白cleaved-PARP、Bax表达上调,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调,以及周期蛋白CyclinDl下调及P21上调。3、以BALB/c免疫缺陷小鼠为研究对象,应用甲状腺乳头状癌细胞系K-1建立移植瘤模型,待皮下肿瘤生长至3*3*3mm3,阿帕替尼100mg/kg/天连续灌胃4周,停药后观察2周,结果显示与对照组相比,阿帕替尼组小鼠移植瘤明显缩小。免疫组织化学染色显示阿帕替尼组小鼠组织中VEGFR2、Ki-67表达下调。4、以甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1为研究对象,免疫荧光染色显示阿帕替尼处理后细胞胞浆中自噬标志蛋白LC3B的表达量明显增加,透射电镜下观察细胞胞浆中自噬小体明显增加。Western-blot结果显示,阿帕替尼联合自噬抑制剂HCQ处理组细胞LC3B表达下降,自噬底物P62表达上调,凋亡蛋白cleaved-PARP表达上调。5、以甲状腺乳头状癌细胞系K-1为研究对象,应用阿帕替尼处理细胞后,应用自噬抑制剂3-MA抑制自噬,应用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,结果显示3-MA明显增强了阿帕替尼诱导K-1凋亡的能力,而单独用药并不能导致K-1的凋亡。Western-blot蛋白检测结果显示,应用3-MA降低了 LC3B的表达,阿帕替尼与3-MA联合应用组上调了 cleaved-PARP的表达,下调了 Bcl-2的表达。6、通过转染小干扰RNA ATG5特异性干扰ATG5的表达抑制自噬,再联合应用阿帕替尼处理细胞,通过Western-blot蛋白检测结果显示,ATG5表达受抑制组细胞,应用阿帕替尼处理,凋亡蛋白cleaved-PARP的表达明显上调。结论:1、甲状腺乳头状癌组织中VEGFR2表达水平比正常甲状腺组织高,且于肿瘤大小、多灶性及淋巴结转移密切相关。2、体内及体外实验证实阿帕替尼可以抑制甲状腺乳头状癌生长,促进凋亡。3、阿帕替尼可以诱导甲状腺癌细胞出现细胞保护性自噬,自噬抑制剂与阿帕替尼联合应用可进一步抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖,诱导PARP/Bcl-2介导的细胞凋亡。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.1
【图文】：
用＇邋Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ邋Ｐｌｕｓ判定结果ｆ〔总，０分、１分为低表达．；２分、３分为：痛表达逡逑组，行统计学分析，发现ＶＥＧＦＲ２阳性患者８６例，阴性患者１０１例，ＶＥＧＦＲ２逡逑阳性率为４６．０％，Ｐ邋＝邋０．０００，见表１．１，两组间差异有统计学意义，见图１．２。逡逑表１．１、１８７例甲状腺乳头状癌患者ＶＥＧＦＲ２免疫组化染色结果逡逑＾ＥＧＦＲ２表达水乎正常甲状腺组织逦甲状腺乳头状癌组织’逡逑０邋分逦２２逦（５１．２％＞逦３３逦Ｕ７．６％）逡逑１邋分逦１９（４４．２％）逦６８逦（３６．４％）逡逑２邋分逦２逦Ｃ４．６％）逦４４逦Ｑ３．５％）逡逑３邋分逦０逦（０．０％）逦４２逦（２２．５％）逦逡逑１００－１逡逑８０－邋＾逡逑Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅ邋Ｐａｒａｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑□邋ＶＥＧＦＲ２邋ｈｉｇｈ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋■邋ＶＥＧＦＲ２邋ｌｏｗ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑图１．２、两组结果经卡方检验，Ｐ＜０．０１，结果有统计学意义逡逑１７逡逑
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织样本中的ＶＥＧＦＲ２的表达水平进行检测，实验数据应用均数土标准差表示，逡逑所有数据至少重复三次，结果显示，与癌旁正常甲状腺组织相比，甲状腺乳头逡逑状癌组织中ＶＥＧＦＲ２的表达水平明显升高ｙ如图１．３所示逡逑Ｃ逡逑．２邋＊＊＊邋Ｔ逡逑Ｉ邋０．０３－，逦逦邋？邋ＴｕｎＷ逡逑＾逦ｔ逦0逦Ｐｅｒｉ－ｔｕｍｏｒ逡逑ｏ逦ｔ逡逑ｚ邋０邋０２－逡逑％逡逑ｃｓ逦逡逑￡邋０．０１－逡逑§＞逦？？？？逦00ｎＡｎ00逡逑＝０．００－Ｉ逦１逦０ｆＴｗ＾ｎｆｌ°逦逡逑＾逦Ｔｕｍｏｒ逦Ｐｅｒｉ－ｔｕｍｏｒ逡逑图１．３、甲状腺乳头状癌组织中ＶＥＧＦＲ２的实时荧光定量ＰＣＲ的检测结果逡逑为验证此结论，本研究随机选取３名甲状腺乳头状患者的癌组织及癌旁ｉｇ逡逑常织，提取组织总蛋白，行蛋白质电泳（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）检测，结果显示，３逡逑例患者癌组织中的ＶＥＧＦＲ２的表达水平明V锤哂诎┡宰橹缤迹保此惧义希危卞澹危插澹危冲澹裕卞澹裕插澹裕冲义希郑牛牵疲遥插义希牵粒校模儒义贤迹保础⒓鬃聪偃橥纷窗┳橹校郑牛牵疲遥驳模祝录觳饨峁义希保玻澹村澹郑牛牵疲遥苍诩鬃聪傧赴抵械谋泶镥义衔嗣魅罚郑牛牵疲遥苍诩鬃聪傧赴抵校恚遥危恋谋泶锼剑τ糜τ檬凳卞义嫌舛╢垼海校茫遥ǎ遥澹幔欤簦椋恚邋澹校茫遥┘觳饧鬃聪侔┫赴靛澹拢茫校粒小ⅲ耍薄ⅲ裕校茫薄ⅲ耍裕茫薄㈠义希茫幔欤叮病ⅲ福担埃担眉罢＜鬃聪俾伺萆掀は赴危簦瑁希颍椋常熘校郑牛牵疲遥玻恚遥危帘泶镥义纤剑峁允炯鬃聪偃橥纷窗┫赴担耍奔埃耍裕茫钡模郑牛牵疲遥插澹恚遥危帘泶锼义掀浇险Ｂ伺萆掀は赴危簦瑁澹希颍椋常焐
本文编号：2750768
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.1
【图文】：
用＇邋Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ邋Ｐｌｕｓ判定结果ｆ〔总，０分、１分为低表达．；２分、３分为：痛表达逡逑组，行统计学分析，发现ＶＥＧＦＲ２阳性患者８６例，阴性患者１０１例，ＶＥＧＦＲ２逡逑阳性率为４６．０％，Ｐ邋＝邋０．０００，见表１．１，两组间差异有统计学意义，见图１．２。逡逑表１．１、１８７例甲状腺乳头状癌患者ＶＥＧＦＲ２免疫组化染色结果逡逑＾ＥＧＦＲ２表达水乎正常甲状腺组织逦甲状腺乳头状癌组织’逡逑０邋分逦２２逦（５１．２％＞逦３３逦Ｕ７．６％）逡逑１邋分逦１９（４４．２％）逦６８逦（３６．４％）逡逑２邋分逦２逦Ｃ４．６％）逦４４逦Ｑ３．５％）逡逑３邋分逦０逦（０．０％）逦４２逦（２２．５％）逦逡逑１００－１逡逑８０－邋＾逡逑Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅ邋Ｐａｒａｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑□邋ＶＥＧＦＲ２邋ｈｉｇｈ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋■邋ＶＥＧＦＲ２邋ｌｏｗ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑图１．２、两组结果经卡方检验，Ｐ＜０．０１，结果有统计学意义逡逑１７逡逑
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