TEM8在NSCLC中的表达及其作用机制的研究

发布时间：2020-07-13 07:49

【摘要】：[目的]探讨TEM8在NSCLC中的表达、生物学功能及分子作用机制。[方法]1.TEM8在NSCLC患者中的表达及其临床意义研究收集67例NSCLC患者手术切除的肺癌组织石蜡标本,应用免疫组织化学染色方法比较TEM8在NSCLC患者癌组织和癌旁组织中的表达,分析TEM8表达与患者临床特征及预后的关系。免疫组织化学染色法对67例NSCLC患者肿瘤组织切片进行CD34标记并进行微血管计数,初步探讨TEM8表达与肿瘤血管生成的关系。收集21例NSCLC患者手术切除的肺癌组织新鲜标本,分别应用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法比较患者癌组织和癌旁组织中TEM8表达情况。单因素生存分析NSCLC患者生存期与TEM8蛋白表达水平及临床病理特征的关系,Cox回归模型分析TEM8表达与NSCLC患者预后的影响因素。2.TEM8与NSCLC细胞生物学行为的关系及机制的体外研究应用慢病毒表达载体构建、筛选稳定沉默和过表达TEM8的宣威肺腺癌XWLC-05细胞株。MTT法检测沉默和过表达TEM8后肺癌细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡及周期变化,扫描电镜观察细胞形态变化,划痕实验观察细胞迁移能力,Transwell实验观察细胞侵袭能力,qRT-PCR和Western blot检测ERK、BCL-2及cyclinD1等分子表达,初步探讨TEM8的体外分子作用机制。3.TEM8对XWLC-05肺癌裸鼠移植瘤模型影响及机制的体内研究将稳定沉默TEM8的XWLC-05细胞接种裸鼠皮下,观察裸鼠一般情况、成瘤情况及肿瘤生长情况。成功接种后的第28天处死裸鼠,测量离体肿瘤的体积和重量,计算肿瘤抑制率。离体肿瘤组织HE、免疫组化和免疫荧光检测TEM8和CD34表达,通过微血管计数观察TEM8表达与NSCLC肿瘤血管生成的关系。qRT-PCR和Western blot检测ERK、BCL-2和cyclinD1等分子表达,初步探讨TEM8的体内分子作用机制。[结果]1..TEM8在NSCLC患者中的表达及其临床意义研究67例NSCLC患者肿瘤组织免疫组化染色提示,TEM8在癌组织中的阳性表达率为52.23%(35/67),在癌旁组织中的阳性表达率为17.91%(12/67),两者差异有统计学意义(P0.05)。21例NSCLC患者肿瘤组织qRT-PCR和Western blot实验证实:在mRNA和蛋白水平,TEM8在癌组织中的表达显著高于癌旁组织,两者之间的差异有统计学意义(P0.01)。TEM8表达阳性的NSCLC患者肿瘤组织微血管密度显著增大,与TEM8表达阴性患者的差异有统计学意义(P0.05),提示TEM8表达可促进NSCLC患者肿瘤血管生成。TEM8表达与NSCLC患者肿瘤分化程度、临床分期、术后发生胸膜侵犯、术后出现远处转移显著相关(P0.05)。单因素生存分析结果显示,NSCLC患者的生存期与TEM8蛋白表达水平、临床分期、是否有远处转移相关(P0.05)。Cox回归模型分析结果提示,TEM8蛋白表达水平、临床分期、是否有远处转移是NSCLC患者预后的影响因素(P0.05)。2.TEM8与NSCLC细胞生物学行为的关系及机制的体外研究沉默TEM8表达后,与空白对照组及阴性对照组相比,MTT检测结果提示细胞增殖能力受到显著抑制(P0.01);流式细胞凋亡检测结果提示细胞凋亡率明显上升,达(24.17±2.16)%(P0.01);扫描电镜观察显示XWLC-05细胞呈现凋亡的形态学改变;流式细胞周期分析结果提示细胞周期被阻滞在G1期(P0.05),从而抑制细胞增殖活性;划痕实验结果提示细胞迁移能力受到显著抑制(P0.01);Transwell实验结果提示细胞侵袭能力受到显著抑制(P0.01);qRT-PCR 和 Western blot 检测结果提示:肺癌细胞 ERK(或 p-ERK1/2)表达显著下调(P0.01),BCL-2、cyclinD1的表达亦显著降低(P0.01)。过表达TEM8后,与空白对照组及阴性对照组相比,MTT检测结果提示细胞增殖能力显著增强(P0.01);流式细胞凋亡检测结果提示细胞凋亡率未见明显变化(P0.05);流式细胞周期分析结果提示细胞周期未被阻滞在G1期(P0.05),而是更多地进入了 G2期,提示肺癌细胞获得了更强的增殖活性(P0.05);划痕实验结果提示细胞迁移能力显著增强(P0.01);Transwell实验结果提示细胞侵袭能力显著增强(P0.01);qRT-PCR和Western blot检测结果提示:肺癌细胞ERK(或p-ERK1/2)表达显著上调(P0.01),BCL-2、cyclinD1的表达亦显著增加(P0.01)。3.TEM8对XWLC-05肺癌裸鼠移植瘤模型影响及机制的体内研究最早于接种后第7天出现肉眼可见的移植瘤,各组裸小鼠均成功成瘤,成瘤率100%。至实验结束时,裸鼠全部存活。实验观察期间,各组小鼠的体重均有不同程度的增长,但组间比较无显著差异(P0.05)。与空白对照组和阴性对照组相比,沉默TEM8表达后,实验组裸鼠皮下移植瘤的生长受到明显抑制,肿瘤抑制率为57.82%,其差异有统计学意义(P0.05)。实验组裸鼠离体肿瘤重量为(0.29±0.04)g,显著低于阴性对照组[(0.58±0.08)g,P0.01]和空白对照组[(0.63±0.17)g,P0.01],空白对照组和阴性对照组肿瘤重量的差异无统计学意义(P0.05)。实验组裸鼠离体肿瘤体积(436.64±102.39)mm3明显小于阴性对照组[(944.18±178.52)mm3,P0.01]和空白对照组[(988.68±128.43)mm3,P0.01],空白对照组与阴性对照组肿瘤体积差异无统计学意义(P0.05)。免疫组织化学及免疫荧光染色显示:TEM8蛋白主要表达于肿瘤细胞膜,实验组TEM8的表达显著低于阴性对照组和空白对照组(P0.05)。CD34主要表达于荷瘤组织中血管内膜,实验组CD34表达显著低于阴性对照组和空白对照组,微血管密度明显低于对照组(P0.05),提示TEM8表达可促进肺癌荷瘤小鼠肿瘤血管生成。qRT-PCR和Western blot检测结果提示:沉默TEM8表达后,与对照组相比,肺癌细胞ERK(或p-ERK1/2)表达显著下调(P0.01),BCL-2、cyclinD1 的表达亦显著降低(P0.01)。[结论]1.TEM8在NSCLC患者癌组织中存在转录和翻译水平的异常表达。2.癌组织中TEM8的表达水平结合临床分期、是否有远处转移等,可作为NSCLC患者病情评估和预后判断的参考指标,具有一定的临床指导意义。3.TEM8可能通过ERK/BCL-2信号通路调控细胞周期蛋白cyclinD1和抗凋亡蛋白BCL-2表达水平,进而调节NSCLC细胞的增殖和凋亡。4.TEM8与NSCLC肿瘤血管生成有关,可能是NSCLC抗肿瘤血管生成治疗的靶点。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

结果逡逑１．免疫组化比较ＴＥＭ８在６７例ＮＳＣＬＣ患者癌组织和癌旁组织中的表达逡逑在免疫组化实验中，ＴＥＭ８蛋白阳性染色呈棕黄色颗粒．在组织中主要定位逡逑于细胞膜（如图１－１所示），在ＮＳＣＬＣ患者癌组织中的阳性表达率为５２．２３％逡逑（３５／６７），在癌旁组织中的阳性表达率为１７．９１％邋（１２／６７），两者比较差异显著逡逑（尸＜０．０５）。逡逑

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—２８ｓ逡逑丨一１８ｓ逡逑图１－２：邋ＮＳＣＬＣ患者癌组织和癌旁组织ＲＮＡ电泳图逡逑（泳道１、２、３所示分别为３例ＮＳＣＬＣ患者肿瘤组织提取总ＲＮＡ）逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋ＲＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＮＳＣＬＣ邋ｓｕｒｇｉｃａｌ邋ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．逡逑（Ｌａｎｅ邋１，２邋ａｎｄ邋３邋ｓｈｏｗｅｄ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋３邋ｃａｓｅｓ邋ｏｆ邋ＮＳＣＬＣ邋ｓｕｒｇｉｃａｌ逡逑ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．）逡逑Ｏｕｒｖｅ逡逑ｉ：：ｒｉ逡逑一－」ｉ＼逡逑ｎ？邋Ｄ邋７0邋ｏ邋ｏ邋ｇｏ邋ｏ邋ａａ．ｏ邋ｏｏ邋ａ邋0？邋ｏ逡逑Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ｆ＊Ｃ）逡逑／＼邋Ｂａａｃ—Ｄ—ＥＢＨＦ邋Ｍ邋Ｇ邋■■邋Ｍ逡逑图１－３：邋ｑＲＴ－

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本文编号：2753176