miR-543通过靶向KLF6调控肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭的机制研究
发布时间：2020-07-14 13:08
【摘要】：研究目的:肾透明细胞癌(Clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是一种发病率非常高的泌尿系统疾病,其发病率在泌尿系统癌症中仅次于膀胱癌。在我国,ccRCC的发病率呈现逐年快速上升趋势。目前对ccRCC发病机制的了解尚不完全清晰,因此需要深入研究ccRCC的发生发展机制,为该疾病的治疗提供新的靶标分子。微小RNA-543(microRNA-543,miR-543)在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中表达异常,miR-543可通过调控靶基因的表达调控肿瘤的发生和发展。Krupple样因子6(Krupple-like factor 6,KLF6)是一个与肿瘤发生和进展密切相关的基因。研究表明,KLF6在ccRCC中异常表达,参与ccRCC的发生和进展过程。生物信息学预测分析显示,KLF6 mRNA的3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)具有和miR-543的结合位点。但是,miR-543是否通过靶向结合KLF6 mRNA 3’-UTR来调控KLF6的表达,并参与ccRCC的发生和进展,目前还没有相关研究。本研究主要分析miR-543在ccRCC组织和细胞中表达水平,并研究miR-543对ccRCC细胞增殖和侵袭等生物学特征的调控作用;另外,阐明miR-543对KLF6的调控作用及其对ccRCC细胞增殖和侵袭的相关调控分子机制;为阐明ccRCC的发病机制提供新的理论基础,并为ccRCC的药物研发和临床治疗提供新的靶标分子。研究方法:1.利用RT-qPCR方法检测miR-543在ccRCC组织和细胞系中的表达水平;利用miR-543 mimics和miR-543 inhibitor转染ccRCC细胞进行miR-543的过表达或抑制表达;利用CCK-8和流式细胞方法检测miR-543对ccRCC细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,细胞侵袭实验检测miR-543对ccRCC细胞侵袭的影响;2.利用生物信息学预测和双荧光素酶报告基因方法研究miR-543和KLF6mRNA 3’-UTR的靶向结合作用;利用RT-qPCR和Western blot方法检测miR-543对KLF6和p21的表达水平的调控作用;利用斯皮尔曼等级相关分析方法分析ccRCC组织中miR-543与KLF6表达水平的相关性;3.利用miR-543 mimics和KLF6表达载体共转染或miR-543 inhibitor和KLF6siRNA共转染实验来明确miR-543和KLF6之间的功能调控关系。研究结果:1.在ccRCC组织和细胞系中,miR-543的表达水平显著上升;过表达miR-543可以促进ccRCC细胞的增殖和侵袭,降低G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率;抑制miR-543的表达则呈现相反的作用;2.生物信息学预测显示,KLF6 3’-UTR具有miR-543的靶向结合序列,荧光素酶报告基因实验证实,miR-543可以直接靶向结合KLF6 3’-UTR;过表达miR-543抑制KLF6的表达,而抑制miR-543则促进KLF6的表达;另外,在ccRCC组织中,miR-543与KLF6表达水平呈负相关性;miR-543可以通过调控KLF6的表达来调控p21的表达;3.KLF6过表达可以逆转miR-543过表达对ccRCC细胞生物学功能的调控作用;而沉默KLF6则可以逆转miR-543表达抑制对ccRCC细胞生物学功能的调控作用。研究结论:miR-543在ccRCC组织和细胞中高表达,可能发挥致癌基因的作用,促进ccRCC细胞的增殖和侵袭,可以靶向结合KLF6 3’-UTR并抑制KLF6的表达,通过靶向调控KLF6的表达来调控p21的表达,通过靶向调控KLF6的表达来调控ccRCC细胞的增殖和侵袭,从而参与ccRCC的发生和进展,为阐明ccRCC的分子发病机制提供了新的理论基础,并为ccRCC的药物研发和临床治疗提供了新的可参考的靶标分子。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11
【图文】：
miRNA 在癌症发生过程中可能发挥促癌作用，导致机体癌症及持续恶化，能发挥抑癌作用，保证机体细胞处于正常生长状态。目前的研究发现，miR-5多种肿瘤细胞中表达异常，如在结直肠癌中，miR-543 表达明显下调，但尚未有报道 miR-543 在 ccRCC 细胞中的表达模式，因此本研究对 miR-543 在该肿瘤细的表达变化进行研究分析。首先利用 RT-qPCR 方法检测了 20 例 ccRCC 患者组其癌旁组织（对照组）中 miR-543 的表达变化，结果显示（图 1-1A），ccRCC中 miR-543 的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.001）；随后检测了多种 ccR胞系（786-O、A-498、Caki-1 和 Caki-2）中 miR-543 的表达水平，结果显示（-1B），与正常肾脏细胞系 HK-2 相比，miR-543 在 786-O、A-498、Caki-1 和 Cak四种细胞系中的表达水平显著上调（P<0.05），其中 miR-543 在 786-O 和 Cak胞系中的表达高于另外两种 ccRCC 细胞系，因此选择 786-O 和 Caki-2 细胞系进入研究。该研究表明，在 ccRCC 发展过程中，miR-543 在 ccRCC 组织及细胞系表达水平显著上升，miR-543 的表达与 ccRCC 的发生发展呈正相关性。
miR-543 的表达水平与癌症的病发可能呈正相关。在人体内或体外培养，癌细胞都具有快速并无限增殖特征，因癌细胞增殖失去机体调控，导致肿瘤不断恶性生长。因此本论文研究分析了 miR-543 在 ccRCC 细胞增殖过程中的调控作用，利用 NC、miR-543 mimics 或 miR-543 inhibitor 分别转染 786-O 和 Caki-2 细胞。首先利用RT-qPCR 检测细胞转染后 miR-543 的表达水平，结果表明（图 1-2A），与 NC 转染组相比，miR-543 mimics 转染组，miR-534 在两细胞系中的表达水平明显上升（P<0.01），而在 miR-543 inhibitor 转染组中，miR-543 在两细胞系中的表达水平则显著下降（P<0.05）。利用 CCK-8 实验检测细胞转染后细胞的增殖变化，结果表明（图 1-2B），与 NC 转染组相比，miR-543 mimics 转染后，两细胞系的增殖能力显著增强（P<0.05），而当 miR-543 inhibitor 转染后，两细胞系的增殖能力则明显减弱（P<0.05）。该研究结果表明，miR-543 可促进 ccRCC 细胞的增殖，miR-543 表达水平上升时，细胞增殖能力增强；而 miR-543 表达水平下降时，细胞的增殖能力减弱。
-543 overexpresison or suppression on 786-O or Caki-2 -8 assay.*P<0.05,**P<0.01 compared with NC.cRCC 细胞细胞周期的影响过程，机体对细胞周期的调控具有非常重要的作用由 G0 向 G1 期转变过程处于非常关键的调控位置细胞周期的调控，从而加速 G0 期细胞转变为 G1 NC、miR-543 mimics 或 miR-543 inhibitor 分别转 G0 期和 G1 期的细胞比例，研究分析 miR-543 对3），与 NC 转染组相比，miR-543 mimics 转染组细），而 miR-543 inhibitor 转染组细胞 G0/G1 比例明，miR-543 可以促进 ccRCC 细胞由 G0 期向 G1 期543 表达沉默会引起 ccRCC 细胞由 G0 期向 G1 期
本文编号：2755013
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11
【图文】：
miRNA 在癌症发生过程中可能发挥促癌作用，导致机体癌症及持续恶化，能发挥抑癌作用，保证机体细胞处于正常生长状态。目前的研究发现，miR-5多种肿瘤细胞中表达异常，如在结直肠癌中，miR-543 表达明显下调，但尚未有报道 miR-543 在 ccRCC 细胞中的表达模式，因此本研究对 miR-543 在该肿瘤细的表达变化进行研究分析。首先利用 RT-qPCR 方法检测了 20 例 ccRCC 患者组其癌旁组织（对照组）中 miR-543 的表达变化，结果显示（图 1-1A），ccRCC中 miR-543 的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.001）；随后检测了多种 ccR胞系（786-O、A-498、Caki-1 和 Caki-2）中 miR-543 的表达水平，结果显示（-1B），与正常肾脏细胞系 HK-2 相比，miR-543 在 786-O、A-498、Caki-1 和 Cak四种细胞系中的表达水平显著上调（P<0.05），其中 miR-543 在 786-O 和 Cak胞系中的表达高于另外两种 ccRCC 细胞系，因此选择 786-O 和 Caki-2 细胞系进入研究。该研究表明，在 ccRCC 发展过程中，miR-543 在 ccRCC 组织及细胞系表达水平显著上升，miR-543 的表达与 ccRCC 的发生发展呈正相关性。
miR-543 的表达水平与癌症的病发可能呈正相关。在人体内或体外培养，癌细胞都具有快速并无限增殖特征，因癌细胞增殖失去机体调控，导致肿瘤不断恶性生长。因此本论文研究分析了 miR-543 在 ccRCC 细胞增殖过程中的调控作用，利用 NC、miR-543 mimics 或 miR-543 inhibitor 分别转染 786-O 和 Caki-2 细胞。首先利用RT-qPCR 检测细胞转染后 miR-543 的表达水平，结果表明（图 1-2A），与 NC 转染组相比，miR-543 mimics 转染组，miR-534 在两细胞系中的表达水平明显上升（P<0.01），而在 miR-543 inhibitor 转染组中，miR-543 在两细胞系中的表达水平则显著下降（P<0.05）。利用 CCK-8 实验检测细胞转染后细胞的增殖变化，结果表明（图 1-2B），与 NC 转染组相比，miR-543 mimics 转染后，两细胞系的增殖能力显著增强（P<0.05），而当 miR-543 inhibitor 转染后，两细胞系的增殖能力则明显减弱（P<0.05）。该研究结果表明，miR-543 可促进 ccRCC 细胞的增殖，miR-543 表达水平上升时，细胞增殖能力增强；而 miR-543 表达水平下降时，细胞的增殖能力减弱。
-543 overexpresison or suppression on 786-O or Caki-2 -8 assay.*P<0.05,**P<0.01 compared with NC.cRCC 细胞细胞周期的影响过程，机体对细胞周期的调控具有非常重要的作用由 G0 向 G1 期转变过程处于非常关键的调控位置细胞周期的调控，从而加速 G0 期细胞转变为 G1 NC、miR-543 mimics 或 miR-543 inhibitor 分别转 G0 期和 G1 期的细胞比例，研究分析 miR-543 对3），与 NC 转染组相比，miR-543 mimics 转染组细），而 miR-543 inhibitor 转染组细胞 G0/G1 比例明，miR-543 可以促进 ccRCC 细胞由 G0 期向 G1 期543 表达沉默会引起 ccRCC 细胞由 G0 期向 G1 期
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 蔡晓沂;钟镐镐;王秀艳;吴秉铨;;快速、准确的B族链球菌检测——即时荧光探针核酸扩增技术的应用[J];现代预防医学;2013年13期
本文编号：2755013
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