端粒酶逆转录酶启动子区多样性及ETV4在非小细胞肺癌中的研究

发布时间：2020-07-16 16:16

【摘要】：背景肺癌为近年来在世界范围内发病率高居第一位的恶性疾病,且为男、女性肿瘤致死的首要原因。由于肺脏为人体唯一暴露在外界环境下的内脏器官,居多证据证明肺癌的发生是在内源环境与外界因素的共同作用下多因素,多基因参与的演变过程。尽管肺癌在临床上十分常见,迄今为止尚未有明确的结论解释肺癌发病的分子机制。端粒是位于真核生物染色体末端长度约为8-20kb的重复序列DNA(TTAGGG)n及相关蛋白组成,主要功能包括保护染色体末端免于融合与降解、并且参与染色体的定位、复制。细胞中维持端粒长度的最主要途径是由端粒酶介导的。端粒酶是由蛋白质与RNA组成的具有逆转录酶活性的核糖核蛋白,具有维持染色体稳定性和完整性的作用,从而保证细胞的正常增殖。目前认为端粒酶的核心部件为端粒酶逆转录酶(TERT,telomerase reverse transcriptase),该酶为维持端粒酶活性的最主要核心物质。TERT启动子区基因的多样性可改变TERT的表达水平,该启动子区转录起始位点上游360bp内的突变可形成Ets/TCF结合序列,对于Ets转录因子家族蛋白具有较高的结合亲性,从而增加TERT的转录水平。ETV4是Ets转录因子家族成员中多瘤病毒增强子3基因(PEA3,Polymoma virus enhancer-3)的成员之一,该因子过表达可导致正常细胞发生恶变,从而增强肿瘤细胞的侵袭与转移能力,但该基因作为Ets家族转录因子对于肺癌的作用尚未了解透彻第一部分:端粒酶逆转录酶启动子区多样性在非小细胞肺癌中的研究研究目的:探讨在非小细胞肺癌(NSCLC,Non-small Cell Lung Cancer)患者肿瘤中TERT启动子突变以及位于启动子区域中rs2853669单核苷酸多态性(SNP,Single Nucleotide Polymorphisms)对TERT mRNA表达及端粒长度的影响,同时分析TERT启动子序列的多样性与表皮生长因子受体(EGFR,Epidermal Growth Factor Receptor)突变的交互作用对TERT mRNA的表达、端粒序列长度以及患者预后的关系。研究方法:1.用聚合酶链式反应(PCR,Polymerase Chain Reaction)对患者肿瘤组织中TERT启动子区以及EGFR第18,19,20,21外显子进行扩增,用Sanger测序法对扩增产物进行测序。2.采用荧光定量PCR检测患者肿瘤组织中TERT mRNA的表达水平,用单色多重荧光定量(MMQPCR,Monochrome multiplex quantitative PCR)检测患者肿瘤细胞中的相对端粒长度。3.建立数学模型分析启动子区的多样性与端粒酶逆转录酶表达水平和端粒序列长度的关系,并探索分析端粒酶启动子多样性在表皮生长因子受体突变的情况下对端粒酶逆转录酶与端粒序列长度的关系、端粒序列长度以及患者生存的影响。结果:1.TERT启动子区多样性检出率250例患者中有11例患者(4.4%)携带经典TERT启动子区变异。其中包括距离转录起始位点-146位置突变(-146CT)4例,距离起始位点-124位置突变(-124CG)2例。此外还包括-166-167CCAA突变两例,-189GA突变两例,-173+C—例。与端粒酶启动子区未发生突变的患者相比,产生突变患者的TERT mRNA表达水平较高(P=0.021),且肿瘤组织细胞中相对端粒长度较长(P=0.039)。2.SNPrs2853669的分布情况与临床特征比较在所检测的250例患者中,共有142名患者携带rs2853669 SNP,其中包括杂合子T/C序列携带者106名,纯合子C/C序列携带者36名。另外108名患者为非rs2853669SNP携带者(T/T)。rs2853669 SNP组间比较显示T/T携带者肿瘤最大长径较大(P=0.025)且多数属于T分期较为晚期的肿瘤(P=0.011)。分析显示携带T/T的肿瘤细胞中TERTmRNA表达水平较高(P=0.005)。3.rs2853669 SNP与EGFR突变的关系T/C携带者EGFR突变产生比率较高(37.7%)(P=0.003)。C/C携带者EGFR突变率最低(16.7%)。其中第19外显子,20外显子突变在T/C携带者中的突变率最高(P=0.033)。4.EGFR突变与rs2853669对TERT mRNA与相对端粒序列长度的影响T/C携带者的病理标本中TERTmRNA表达量最高,其次为T/T携带者(Pc/c Vs.T/C0.01,PC/CVS.T/T=0.043)。在EGFR未突变的情况下该差异的统计功效更为明显 P C/C Vs.T/C0.001,PC/c Vs.T/T=0.032)。在EGFR突变的情况下,只有T/C序列携带者的端粒酶逆转录酶mRNA表达量高于T/T序列携带者(P=0.023)。杂合子T/C序列携带者肿瘤中相对端粒长度最长但差别未能达到统计学意义(PT/C VS.T/T=0.052,PT/C vs.c/c=0.071)。然而该差异在EGFR未突变的患者中具有统计学意义(PT/C VS.T/T=0.039,PT/C VS.C/C=0.039)。5.EGFR突变与rs2853669 SNP的交互关系对NSCLC患者生存的影响携带杂合子T/C与纯合子T/T,C/C的NSCLC患者的生存期中位数分别为(64.74+3.1)月,(80.02+2.4)月与(76.3+2.4)月,且存在显著性差异(P=0.001),无病生存期分别为(65.7+3.1)月,(81.3+2.4)月与(74.9+2.8)月,同样存在显著性差异(P=0.027)。且这种差异只会出现在EGFR为发生突变的患者组中。在EGFR突变的患者中,总生存期与无病生存期未出现显著性差异。结论:1.TERT启动子突变与rs2853669 SNP可调节端粒酶逆转录酶mRNA的表达并且对相对端粒长度有影响。2.TERT启动子突变与rs2853669 SNP可影响NSCLC患者的总生存率与无病生存率。3.rs2853669SNP对端粒生物学的调节受患者EGFR突变状态的影响。第二部分:ETV4蛋白下调抑制非小细胞肺癌增殖机制的研究研究目的:采用荧光定量PCR检测NSCLC患者癌与癌旁组织标本中ETV4的表达水平,在体外实验中下调非小细胞肺癌细胞系中ETV4的表达,观察细胞的增殖情况,并对可能的分子机制进行探索研究。研究方法:1.用定量PCR分析76名非小细胞肺癌患者癌与癌旁组织中ETV4的表达差异,以及TERT启动子突变与rs2853669对ETV4表达的影响。2.人为下调NSCLC细胞系中ETV4的表达,观察其对细胞系增殖与TERT的影响。3.体用蛋白质印记技术、流式细胞仪探究ETV4下调抑制细胞增殖的机制结果:1.癌组织与癌旁组织相比ETV4表达量较高(P=0.001),携带TERT启动子突变的患者ETV4表达量相对较高(P=0.08),携带rs2853669 TC(P0.01)与TT(P=0.072)等位基因的患者ETV4表达量较高。2.下调H661,HCC827与A549细胞系中ETV4表达后细胞增殖受到抑制且导致G0/1期细胞周期阻滞;下调ETV4后H661与A549细胞中cyclinD1、cyclinD3、CDK4余P21蛋白以及磷酸化erk有所下调(P0.05)。3.下调H661与HCC827细胞中ETV4表达后TERT的表达也有所下调(P0.05);在A549细胞中沉默ETV4后可下调AP-1家族蛋白LEF-1、β-caterin与J-Jun的表达水平。结论:1.非小细胞肺癌组织相对癌旁组织ETV4表达量显著升高。TERT启动子突变携带者与rs2853669 SNP TC与TT等位基因携带者呈高表达ETV4。高ETV4与较大的肿瘤最大长径与淋巴结转移有统计学相关意义。2.体外实验表明下调ETV4的表达水平可通过引起G1/G0期细胞周期阻滞,该周期阻滞可能是由激活erk通路对周期蛋白相关底物进行去磷酸化而导致的。3.下调ETV4的表达水平可同时下调AP-1转录家族基因,提示在非小细胞肺癌中,Ets转录家族ETV4与AP-1转录家族基因之间存在相互调节作用,从而对TERT的表达可能存在共性调节作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

患者,点突变,启动子区,相关性分析

动子的突变与ｒｓ２８５３６６９等位基因表型。其中包括１４９名男性患者，１０１名女性患逡逑者。患者的平均年龄为６０．邋３邋±１０岁（表１）。结果显示共有１１例患者（４．４％）携逡逑带ＴＥＲＴ启动子突变（表２，图１）．包括６例肺腺癌患者与５例肺鳞癌患者，这些逡逑突变包括２例－１４６邋Ｃ＞Ｇ突变，４例－１２４邋Ｃ＞Ｔ突变，３例－１８９Ｇ＞Ａ突变与２例逡逑－１６７，－１６６，ＣＣ＞ＡＡ突变。ＴＥＲＴ启动子肺腺癌中的突变率为（６／１６３，邋３．邋７％），在肺鳞逡逑癌中的突变率为５．邋７％邋（５／８７）。逡逑逦表１邋２５０名ＮＳＣＬＣ患者基础临床信息逦逡逑ＴＥＲＴ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋Ｓｔａｔｕｓ逡逑Ｍｕｔａｔｅｄ逦ＷＴ逡逑￣Ｎｏ￣％￣邋＂ｌ＾ｏ￣Ｐ逡逑Ａｌｌ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ逦Ｕ￣４Ａ逦２３８邋９５．６逡逑Ａｇｅ邋ａｔ邋ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，邋ｙｅａｒｓ邋６２．５邋±邋７．９逦６０．５逦±邋９．７逦０．５９９逡逑Ｓｅｘ，邋ｍａｌｅ逦７逦５８．３逦１４２逦５９．７逦０．７８０逡逑Ｓｍｏｋｅ逦４逦３３．３逦４９逦２０．６逦０．２０８逡逑Ｄｒｉｎｋ逦２逦１６．７逦４２逦１７．６逦０．９５９逡逑表２：逦１１例携带ＴＥＲＴ启动子点突变患者信息逡逑ＩＤ逦ＴＥＲＴ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ逦Ｔｕｍｏｒ邋ｓｉｚｅ邋Ｎ邋Ｔ逦ＴＮＭ逡逑ｎｕｍｂｅｒ逦Ａｇｅ逦Ｇｅｎｄｅｒ逦Ｍｕｔａｉｏｎ逦Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ逦（ｃｍ）逦ｓｔａｇｅ逦ｓｔａｇｅ逦Ｇｒａｄｅ逦ｓｔａｇｅ逡逑￣５逦７１逦Ｍａｌｅ逦－１８９Ｇ＞Ａ逦ＳＣＣ逦９ｌ逦０逦４逦ｉ逦ＩＩＩＡ逡逑６逦６５逦Ｆｅｍａｌｅ逦－１６７

患者,预后分析,点突变,粒长

动子点突变与肿瘤大小、类型、分化程度、浸润事件、ＴＮＭ分期并无相关性，但携逡逑带ＴＥＲＴ启动子突变患者的ＴＥＲＴ邋ｍＲＮＡ表达水平高于未发生突变的患者（－１３．１７逡逑±ｌ．ｌｖｓ．－１４．５±１．８．Ｐ＝０．０２１）（表３，图２）。且相对端粒长度也大于未携带突变逡逑的患者（丨．０５±０．３５邋ｖｓ．０．８６±０．３，Ｐ＝０．０３９，表３，图２）。随后我们分别分析了肺逡逑腺癌与肺鳞癌患者中ＴＥＲＴ启动子突变与临床信息之间的关联性，发现只有在肺逡逑腺癌中

启动子区,患者,携带者,等位基因

１．邋４邋ｒｓ２８５３６６９邋ＳＮＰ不同等位基因在非小细胞肺癌的分布。逡逑我们扩增的启动子区包括了位于起始位点上游－２４５ｂｐ位点的－２８５３６６９邋ＳＮＰ。逡逑其中包括纯合子等位基因Ｔ／Ｔ邋（野型），Ｃ／Ｃ与杂合子Ｔ／Ｃ（变异型）。其中Ｔ／Ｔ与逡逑Ｔ／Ｃ的携带者分别为１０８邋（邋４３．２％）名患者与１０６邋（邋４２＿邋４％）名患者。Ｃ／Ｃ等位基因逡逑携带者为３６邋（１４．邋４％）名。Ｔ／Ｔ等位基因携带者中有６２邋（邋５７．邋４％）名肺腺癌患者，逡逑４６邋（邋４２．邋６％）名肺淲癌患者。Ｔ／Ｃ等位基因携带者中有７４邋（邋６９．邋８？／４）例肺腺癌患者，逡逑３２邋（邋３０．邋１％）名肺鳞癌患者。Ｃ／Ｃ等位基因携带者中有２７邋（７５％）名肺腺癌患者，逡逑９（２５％）名肺淲癌患者。逡逑１．邋５邋ｒｓ２８５３６６９邋ＳＮＰ不同等位基因与ＮＳＣＬＣ患者临床信息相关性分析逡逑我们分析了邋ｒｓ２８５３６６９不同等位基因与患者临床信息之间是否具有相关性。结逡逑果见表４。分析结果显示，在所有患者中，ｒｓ２８５３６６９与患者的年龄，性别无相关逡逑性。Ｔ／Ｔ携带的肿瘤最大长径最大（Ｔ／Ｔ：邋Ｔ／Ｃ：邋Ｃ／Ｃ邋＝邋３．５邋士邋１．邋８：邋３．邋０邋±邋１．５２：逡逑２．９邋±邋１．１５，邋Ｐ＝０．邋０２５邋）（表４），且与另外两个等位基因相比，归类于中央型肺逡逑

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