Wnt信号调控结肠癌恶性行为的表观遗传分子机制

发布时间：2020-07-17 14:20

【摘要】：【背景】MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为21-25个核苷酸的非编码单链小分子RNA,可以通过特异性地识别和结合3’-UTR区的互补序列,降解或抑制mRNA的翻译来抑制靶基因的表达。它们广泛参与了细胞分化、增殖、凋亡、组织器官发育等生理过程,也是肿瘤恶性行为的重要调控因子。因为miRNA在进化上的保守性和在细胞内作用的广泛性,在各种肿瘤细胞中表达异常的miRNA,尤其是广泛下调的抑癌性miRNA一直被认为是激活癌基因、促进肿瘤发生发展的重要影响因子。Wnt信号作为影响细胞生长发育的关键性通路,已被证实在很多肿瘤中异常表达,其中最常见的便是结肠癌。经典的Wnt信号由细胞内抑癌基因APC的突变移除或致癌基因β-catenin的激活启动,继而通过β-catenin在细胞核内的聚积及其与转录因子TCF4的结合激活下游基因c-Myc和CCND1等的转录。除这一经典的转录激活作用外,不少研究也证实了TCF4单独或与β-catenin一起对Wnt通路下游基因的转录抑制作用。在这些受调控的基因中,近期研究报道了miRNA作为转录后调控因子,也分布在Wnt通路的调控网络中。其中受Wn信号负性调控的抑癌性miRNA,虽然被报道过,但作为一个经典的转录激活性通路,Wnt是如何抑制这些抑癌性miRNA表达的机制确从未被揭示过。本课题将对这一未回答的问题进行研究。【目的】研究结肠癌中Wnt信号调控miRNA的分子机制,探索这些miRNA在肿瘤恶性行为中的作用与功能,为结肠癌的诊断及治疗提供新的靶点。【方法】第一部分:通过分析TCF4在HCT116细胞中的ChIP-seq数据库、干扰内源性TCF4表达以及对候选miRNA启动子区的ChIP-qPCR检测,确定要研究的被Wnt信号调控的miRNA;在激活和抑制Wnt信号的情况下,用qPCR检测该miRNA的表达以确定调控关系;通过ChIP-qPCR检测该miRNA启动子区是否有Wnt信号核心转录复合物TCF4-β-catenin的结合富集。第二部分:通过GEO数据库分析和临床标本的检测,确定研究对象miR-145在原发和转移结肠肿瘤中的表达差异;通过划痕和Transwell实验,在体外验证miR-145对结肠癌细胞侵袭和转移功能的影响;通过建立裸鼠结肠癌肝转移和肺转移模型,在体内验证miR-145对结肠癌细胞转移的影响。第三部分:通过Western Blot和荧光素酶报告基因验证miR-145影响结肠癌侵袭和转移的靶基因;通过回复实验验证miR-145是否通过该靶基因影响结肠癌细胞的转移功能;在结肠癌转移的动物模型和临床标本中检测miR-145及其靶基因表达的相互关系。第四部分:通过ChIP-qPCR检测miR-145启动子区是否有H3K27me3及其甲基化酶PRC2复合物的富集,并通过GSK-J4增加或siEZH2/siSUZ12干扰这些成分的表达,观察miR-145的水平是否会随之变化;通过Co-IP及Re-ChIP实验验证TCF4-β-catenin复合物是否能和PRC2复合物在TCF4结合位点发生直接作用;同样用ChIP-qPCR检测H3K27me3和PRC2复合物在启动子区的富集状况,并在提升胞内H3K27me3水平或干扰PRC2复合物时检测表达水平,验证其他候选的Wnt信号负调miRNA是否也存在类似的调控规律。第五部分:通过在结肠癌细胞中转染mimic miR-145后用TOP-Flash/FOP-Flash报告基因检测Wnt信号的活性、用qPCR检测pre-miR-145的表达以及用ChIP-qPCR检测miR-145的负调因子在其启动子区的富集情况,确定miR-145是否可反向抑制Wnt信号形成负反馈环路;通过RNA Hybrid软件分析、Western Blot和荧光素酶报告基因验证miR-145反向抑制其负调因子时靶向的基因;在裸鼠成瘤模型和临床病例的标本中验证miR-145及其负调因子形成的双负反馈环路。【结果】第一部分:在一系列筛选和检测中我们发现,在结肠癌细胞中干扰内源性TCF4表达后,miR-145的表达上升最为明显,并且其上游启动子区具有最显著的TCF4富集,让我们决定选择miR-145作为具体研究的对象;在Wnt信号激活和抑制的情形下,miR-145的表达分别出现了下降和上升;我们在miR-145的启动子区发现了TCF4的结合位点,ChIP-qPCR检测的结果显示,在该位点附近有显著的TCF4-β-catenin结合富集。第二部分:GEO数据库的分析及41对严格匹配的结肠癌原发瘤和转移瘤检测结果显示,miR-145在结肠癌转移瘤中的表达显著下调;划痕和Transwell实验的结果显示,miR-145可在体外有效抑制结肠癌细胞的侵袭和转移;裸鼠转移模型的结果显示,miR-145可在体内有效抑制结肠癌细胞向肝脏和肺脏发生转移。第三部分:Western Blot和荧光素酶报告基因的结果显示,miR-145可特异性结合在LASP1的3’-UTR区,靶向沉默其表达;回复实验的结果显示,LASP1的回复表达可部分中和miR-145对结肠癌细胞转移的抑制作用,说明miR-145的确通过靶向沉默LASP1的表达抑制结肠癌细胞的转移;miR-145与LASP1的表达在结肠癌肝和肺转移的动物模型以及41例转移癌的临床标本中,都呈负性相关关系。第四部分:ChIP-qPCR检测显示miR-145启动子区的TCF4结合位点处有显著的H3K27me3及PRC2复合物的富集,用GSK-J4处理细胞使胞内H3K27me3水平增加时,miR-145表达下调,而用siEZH2/siSUZ12干扰PRC2复合物的表达富集时,miR-145的表达水平上升;Co-IP和Re-ChIP实验的结果显示,TCF4-β-catenin复合物可在miR-145启动子区的TCF4结合位点通过直接结合的方式招募PRC2复合物,使其对该区域的组蛋白进行H3K27三甲基化,下调miR-145的表达;在候选的同样受Wnt信号负调的抑癌性miRNA中,miR-132/212的启动子区亦具备类似的调控模式。第五部分:在结肠癌细胞中转染mimic miR-145后,我们发现了Wnt信号活性的下降、pre-miR-145表达稳定而持续的上升以及在其启动子区结合的TCF4-β-catenin和PRC2复合物的富集下降,说明miR-145的确能反向抑制其负调因子;Western Blot和荧光素酶报告基因的结果显示,miR-145可直接结合在TCF4和SUZ12的3’-UTR区,靶向抑制其表达,与负调它的TCF4-β-catenin和PRC2复合物形成了双向负性的反馈环路;在裸鼠成瘤模型和临床病例的分析中,我们观察到miR-145的表达与其负性调控因子或靶分子之间,都呈现出负性相关关系。【结论】1.miR-145能通过靶向沉默LASP1来抑制结肠癌侵袭和转移的能力;2.Wnt信号通过TCF4-β-catenin复合物结合在miR-145等抑癌性miRNA上游启动子区的TCF4结合位点,并招募PRC2复合物对这一区域的组蛋白进行H3K27三甲基化,从而实现对miR-145等抑癌性miRNA的负性调控;3.miR-145可通过靶向沉默TCF4和SUZ12这两个关键的负调因子,与Wnt信号及PRC2复合物形成双负反馈的调控环路。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.35
【图文】：

图 1：miRNA 的生物学合成过程，引自 Biomed Pharmacother. 2018 Jan;97:1319-13301.2 miRNA 的作用特点miRNA 在脊椎动物、无脊椎动物和植物中都具有高度保守性，并通过对靶向mRNA 阻断翻译过程和进行降解，在转录后调控中发挥重要作用[9]。1993 年，美国哈佛大学的研究人员首次报道了在秀隐线虫的生物学功能中发挥作用的 lin-4[10]。

空军军医大学博士学位论文体内多达三分之一的基因的表达[12]。也有越来越多的证据表明，异常表达的 miRNA对各种肿瘤的发生发展和恶性行为都有重要影响，可以表现为下调抑癌基因的致癌性 miRNA 表达上调，或靶向致癌基因的抑癌性 miRNA 表达下降[13, 14]。2. miRNA 在结肠癌分子调控网络中的研究现状越来越多的证据表明，结肠癌的发生发展与致癌性信号通路的激活和抑癌性通路的失活相关，其中，基础实验和临床流行病学的研究也表明，miRNA 在这一过程中发挥了关键性作用[15]。已有的研究显示，miRNA 可通过间接或直接调控 Wnt、Ras、TGF-β和炎症反应等致癌性通路[16]，也可通过影响结肠癌的侵袭转移能力及肿瘤干细胞的功能等方面参与其恶性进程[17]（图 2）。

究人员还发现，miR-93 不论在结肠癌细胞系还是临床标本中，都呈现且具有抑制 Wnt 通路组分的潜在作用[84]；进一步研究发现，miR-93 是帮助β-catenin 入核的蛋白 smad-7 来降低 Wnt 通路活性的[85]。miR-101癌细胞中抑制 Wnt 通路的活性，在细胞内过表达 miR-101 能降低细胞环境下生长和侵袭迁移的能力[86]。近年来关于结肠癌细胞中重要的miR-145 的研究显示，它能通过靶向抑制 cateninδ-1 这一结合于 p21 活（PAK4）参与细胞骨架重塑的蛋白，PAK4 是帮助β-catenin 入核转运的iR-145 能通过减低β-catenin 的入核，来抑制 Wnt 通路活性发挥抑癌功，miR-506 和 miR-320a 在结肠癌中的表达也显著下降，它们能通过抑身或下游的效应分子 c-Myc 和 cyclin D1 来阻碍肿瘤的发生发展[88, 89]。明，无论致癌还是抑癌性的 miRNA，都通过调控或被调控的方式与 W网络交织在一起，在结肠癌的发生发展中发挥着重要作用（图 3）。

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