循环肿瘤细胞团转录组分析新方法

发布时间：2020-07-21 07:12

【摘要】：肿瘤转移是目前癌症患者死亡的主要因素,在肿瘤转移过程中循环肿瘤细胞团(circulating tumor microemboli,CTM)被认为是肿瘤转移的“种子”,最新的研究显示CTM具有高的转移潜能,而CTM中包含的不同细胞类型为CTM的转移潜能提供了有利环境。因此对CTM中的每一个细胞做进一步研究有利于揭示肿瘤转移的机制。单细胞转录组分析技术是分析单个细胞中位于表型末端的转录组信息,提供了对CTM中的每个细胞进行分析的技术基础,但是要对CTM中的细胞进行单细胞转录组分析还需要解决以下问题:(1)CTM在患者中的流行率很低,需要构建CTM模型来满足对CTM基础研究的需求;(2)如何从血液中捕获到完整的CTM并将CTM解聚为单细胞且不影响细胞中的RNA水平;(3)如何对分解得到的单个细胞进行准确的mRNA定量分析。首先针对CTM来源少的问题,本课题采用了低浓度胰酶消化法和悬浮培养法构建了 CTM体外模型,两种方法均能产生细胞活性好、稳定的CTM模型,但是低浓度胰酶消化法产生的单细胞数较细胞团数多一个数量级,悬浮培养法产生的细胞团和单细胞的数量相近,因此悬浮培养法产生的细胞团数所占比例更高。为进一步模拟CTM的生理状态,我们构建了荷瘤动物模型,并在荷瘤动物的循环血中获得了 CTM体内模型。针对CTM前处理的问题,本课题评价了三种不同的CTM解聚试剂和三种不同的CTM富集方法。在三种不同的CTM解聚试剂的考察中,Tissue(tumor)dissociation/single cell isolation kit 不能完成 CTM 的解聚;胰酶-EDTA 可以在 2 min左右解聚CTM,但是胰酶-EDTA会造成单细胞中RNA的严重降解;无动物蛋白胰酶替代物可以在2 min左右将CTM解聚为单细胞,并且经无动物蛋白胰酶替代物处理的细胞中RNA的含量与新鲜细胞RNA含量没有显著差异。在三种CTM富集方法中,负性筛选方法无法保持CTM的完整性,在富集结束后CTM均解聚成为了单细胞;膜过滤的方法能较好保持CTM的完整性,但是回收后的CTM被流体压力锚定在滤膜上,无法进行下步的单细胞分离;正性分选的方法具有较好的回收率,能较好的保持CTM的完整性,并且可以偶联下游的单细胞转录组分析。因此我们选择了正性分选富集CTM并采用无动物蛋白胰酶替代物对CTM进行解聚,构建了无损的CTM前处理方法。针对单细胞转录组技术的问题,本课题在已经报道的Beads-seq的基础上加入了独立分子标签(Unique molecular identifiers,UMI),构建了 Beads-UMI-seq无偏倚的固相单细胞cDNA建库技术,本课题将6 nt的UMI添加在mRNA的捕获引物上,使得逆转录后的cDNA都带上不同的UMI,并且根据加入UMI后的序列我们优化了 PCR体系中dATP和dTTP的量,使Beads-UMI-seq的建库产物可以满足高通量测序要求。该方法既保留了 Beads-seq高效扩增的特点,又加入了分子标签达到校正建库过程中扩增偏差的目的。本课题从CTM体内体外模型的建立、CTM前处理方法的建立和无偏倚的固相单细胞转录组建库方法的建立三个方面构建了 CTM转录组分析的新方法,为进一步探究CTM在肿瘤转移中的作用提供了技术基础。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R73-3

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本文编号：2764071