癌细胞中OCT4B的功能及所调控的p53新变体研究

发布时间：2020-07-21 09:42

【摘要】：随着分子水平上对基因的深入研究,单个基因呈现出复杂的生物学功能。部分基因的可变表达形式在控制发育分化方面的作用已经较为清晰,但在癌症发生过程中的作用尚不清楚。OCT4作为ES细胞的重要转录因子,其在癌细胞中的表达已基本得到确认。之前研究证实,OCT4B变体表达于人乳腺癌细胞MCF-7,但功能尚不明确。本论文将继续探究OCT4B在乳腺癌细胞中具有的生物学功能及其可能的调控途径。并首次发现了四种与OCT4B密切相关的新p53变体(p53variants),初步研究了这几种变体在不同细胞系中的表达调控关系,为正常成体细胞变异、癌化、癌细胞基因治疗提供了理论基础。1)通过对四种不同的人乳腺癌细胞系中OCT4表达的检测明确其在癌细胞中可能的意义。检测发现OCT4B普遍表达于人乳腺癌细胞中,此外干细胞的关键基因OCT4A在四种乳腺癌细胞中也有不同程度的表达。暗示OCT4基因的激活尤其是OCT4B的表达可能对于乳腺癌的发生或发展具有特定意义。2)通过RT-PCR和Real-time PCR检测了解OCT4B在乳腺癌细胞MCF-7中对癌症相关基因表达的调节。检测发现OCT4B与细胞周期和细胞凋亡的途径密切相关,过表达OCT4B能够明显上调原癌基因Bcl-2的表达,因此推测OCT4B可能具有类似于原癌基因的功能。进一步利用流式细胞技术进行研究,发现内源的OCT4B下调时癌细胞出现大量的凋亡,并且细胞出现明显的G1期阻抑。这个结果表明,OCT4B具有促进癌细胞增殖、抑制凋亡的功能。3)OCT4的两种剪切形式在人乳腺癌细胞中都能表达,二者间是否能够相互调节,对于真正了解OCT4B在癌细胞中的功能至关重要。研究表明,过表达外源OCT4B可以上调MCF-7细胞的内源OCT4A表达。同样的,外源OCT4A对OCT4B的表达也起到一定上调的作用,但其对于p53、Bcl-2的影响远远不及OCT4B作用明显。结果表明,癌细胞中OCT4B有着相对独立的重要功能。4)发现一种与OCT4B正相关的新p53变体(p53i8,后更名为p53i8ε)。该变体mRNA序列包含野生型p53完整的第八内含子序列,缺失了野生型p53所具有的核定位信号、核转移信号和寡聚化结构域。过表达p53i8ε能明显上调Bcl-2/BAX的比率。并且该变体受OCT4B正调节。推测OCT4B的功能途径是通过调节p53可变表达,利用p53i8ε来上调Bcl-2表达,进而促进乳腺癌增殖、抑制凋亡。5)进一步探索p53复杂功能与p53不同变体的关系。在MCF-7中发现另外四种新的p53剪切变体,根据序列特点分别命名为p53i7η、p53i8ε(即p53i8)、p53i8ζ和p53i9δ,以及一种缺失型的变体p53e5d。这些变体编码的蛋白都具有完整的p53 N-端结构域。研究分析了不同细胞系及组织中p53变体的表达特点及功能,发现部分变体受OCT4B表达调节,为今后深入研究OCT4B与p53变体在癌细胞中的功能机制奠定基础。本论文的研究发现为基因组上单个基因的表达与功能多样性提供了直接证据。揭示了OCT4基因变体与p53基因变体之间存在着特定的功能联系。为细胞转化／癌变提供新的检测手段,为癌症基因治疗提供了新的研究方向。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【图文】：

过转录水平和蛋白表达的检测，确定了本实验构建干涉载体的有效性。实验结果显示，过表达外逡逑源０ＣＴ４Ｂ时，检测细胞转录和蛋白水平０ＣＴ４Ｂ都明显提高；转染ＯＣＴ４干涉载体后，内源０ＣＴ４逡逑表达量明显下调（如图２－１２Ａ和１２Ｂ）。逡逑５５逡逑

序列具有与ＦＬｐ５３（野生型全长ｐ５３）完全相同５’端序列，但不同在于，在第８外显子的后面多出逡逑了一段９２ｂｐ的序列，经比对是化－ｐ５３基因的全部第８内含子的序列，故暂将此ｐ５３变体命名为逡逑ｐ５３巧（如图２－１８）。由于这段保留的内含子序列在其最后会产生一个新的终止密码子ＴＡＱ使所编逡逑码ｐ５３ｉ８蛋白的失去了全部Ｃ端功能域，包括核定位信号、核运输信号等（如图２－１９），意味着逡逑ｐ５３巧可能失去了邋ＦＬｐ５３的原有的转录因子功能。逡逑Ｐ邋巧识（｜Ｃ逦ｐ５３ｑ逡逑■逦ＥＭＩＲＭＨｌ］——ＩＭＭ－逡逑Ｉ邋向逦ｉｉ＊）＜逡逑Pt…８）击８逡逑图２－１７ｐ巧ｉＳＰＣＲ引物位ａ逡逑ｐ５３为通用引物，ｐ５３邋（ｅ４－ｉ８）为新变体特异引物。ｐ５３巧ｑｃ为ｐ５３旧特异性黄化定量ＰＣＲ引物，ｐ５３ｑ为通用费化定量逡逑ＰＣＲ引物。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１７邋Ｔｈｅ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐ５３邋ｐｒｉｍｅｒｓ．逡逑ｐ５３邋ｉｓ邋ｕｎｉｖｅｒｓａｌ邋ｐｄｍｅｒｓ、ｐＷ邋（ｅ４－ｉ８）邋ｉｓ邋化ｅ邋ｎｅｗ邋ｖａｒｉａｎｔ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｐｒｉｍｅｒｓ．邋ｐ５引８ｑｃ邋ｉｓ邋化ｅ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣ民邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｏｆ逡逑ｐ５３ｉ８，邋ｐ５３ｑ邋ｉｓ邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｉｍｅｒｓ．逡逑６２逡逑

过转录水平和蛋白表达的检测，确定了本实验构建干涉载体的有效性。实验结果显示，过表达外逡逑源０ＣＴ４Ｂ时，检测细胞转录和蛋白水平０ＣＴ４Ｂ都明显提高；转染ＯＣＴ４干涉载体后，内源０ＣＴ４逡逑表达量明显下调（如图２－１２Ａ和１２Ｂ）。逡逑５５逡逑

本文编号：2764243