翻译起始因子eIF3b在胃癌发生发展中的作用研究

发布时间：2020-07-22 02:46

【摘要】：研究背景胃癌是一种源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤,近年来,胃癌发病率在全球范围内有所下降,但在中国胃癌的发病率和死亡率均高居第二位,对人类健康依然有严重的威胁。胃癌的发生发展是一个复杂的、多因素参与的过程,基因表达调控的异常在胃癌的发生中发挥关键作用。对基因最主要的调控发生在转录和翻译水平,最终表达的蛋白产物可直接或间接地作用于调控细胞增殖、凋亡、迁移等重要生物学功能的信号通路而发挥作用。目前,蛋白翻译水平的调控,尤其是对翻译起始步骤的研究,已经证明真核翻译起始因子eIFs(eukaryotic initiation factors)能通过对蛋白翻译和细胞周期的调控,在肿瘤的发生发展中发挥关键性的作用。真核翻译起始因子eIF3是eIFs中最复杂,也是最重要的一个多亚基复合物,目前已确定包含的亚单位有13个(eIF-3a,-3b,-3c...-3m)。eIF3通过与其它翻译起始因子的相互作用促使43S核糖体复合物前体的形成,进而结合mRNA,识别起始密码子AUG,在翻译起始过程中发挥关键作用。这一功能主要借助于eIF3的核心亚基eIF3a、eIF3b、eIF3e、eIF3f、eIF3h以及eIF3i,研究发现,这6个亚基在众多肿瘤中均有异常表达,与肿瘤的发生密切相关。eIF3b由于其结构的特殊性,在eIF3复合物中起着脚手架功能,人类eIF3b带有RNA识别序列(RRM),位于蛋白质N端,RRM结构域可以提供一个特定位点,使eIF3b与eIF3J等其它亚基相互作用。目前,大量研究提示eIF3b通过对蛋白翻译的调控参与细胞周期、凋亡、细胞侵袭和迁移等癌症相关信号通路,影响肿瘤的发生发展。eIF3b已被证明在前列腺癌和膀胱癌中过表达,以及它的过度表达与癌症预后有关;eIF3b沉默表达能抑制结肠癌细胞和成胶质细胞瘤细胞的增殖;eIF3b在骨肉瘤、食管鳞状细胞癌和肾细胞癌中均异常表达,对癌细胞的侵袭和迁移起到了推动作用。然而,eIF3b在胃癌中的表达情况及其在胃癌的发生发展中是否发挥作用目前尚无报道。因此,本实验研究了 eIF3b在胃癌中的表达情况及其在胃癌发生发展中的作用。实验目的研究eIF3b在胃癌细胞和组织中的表达情况及其对胃癌细胞增殖和转移的作用及机制,探讨eIF3b作为胃癌诊断标志物和治疗靶点的潜在价值。1.eIF3b对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响QRT-PCR检测不同的胃癌细胞系(SGC7901、BGC823、MGC803、AGS和HGC27)中eIF3b mRNA的表达水平。利用eIF3b的小干扰RNA转染至eIF3b mRNA表达水平较高的两个细胞系SGC7901和MGC803中,用QRT-PCR和Western blot检测其对eIF3b基因表达的干扰效果,通过克隆形成实验和CCK8细胞活力实验检测下调eIF3b对胃癌细胞增殖能力的影响;通过Transwell迁移实验和细胞划痕实验检测下调eIF3b对胃癌细胞迁移能力的影响;通过Transwell基质胶侵袭实验检测下调eIF3b对胃癌细胞侵袭能力的影响。2.动物实验检测eIF3b在体内对胃癌细胞增殖和转移的影响利用慢病毒(Lentivirus)包被的eIF3b的干扰载体处理胃癌细胞SGC7901,可有效将外源基因整合到宿主染色体上,从而持久性的下调eIF3b的表达,QRT-PCR 检测干扰效率,将 Lentivirus-negative control 和 Lentivirus-eIF3b 感染成功的SGC7901细胞分别接种到裸鼠皮下和尾静脉,观察裸鼠皮下成瘤和肿瘤肺部转移情况,观察在体内下调eIF3b对胃癌细胞增殖和转移的影响。3.eIF3b调控胃癌相关信号通路中重要基因的表达慢病毒包被的eIF3b的干扰载体感染胃癌细胞SGC7901和MGC803,Western blot和ELISA检测能影响胃癌细胞增殖、侵袭和迁移相关的信号通路中重要基因的表达情况,包括 p27、E2F1、AKT、IL-8、Vimentin、CyclinD、CyclinE 和β-catenin等。根据检测结果,选择下调比较明显的E2FI分子进行后续的拯救实验,将高表达的E2F1质粒和eIF3b的特异性小干扰共转染到SGC7901和MGC803细胞中,设置 si-NC + pcDNA-NC、si-eIF3b + pcDNA-NC、si-eIF3b + pcDNA-E2F13组分别进行克隆形成和Transwell实验,验证下调eIF3b的表达能够直接或间接地调控胃癌相关信号通路中重要基因的表达从而影响胃癌细胞的增殖和转移。4.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌组织标本中的表达QRT-PCR检测39例人慢性胃炎和正常胃粘膜组织标本以及46对胃癌和远端癌旁组织标本中eIF3b的mRNA表达水平,免疫组化检测胃癌组织切片中eIF3b的蛋白表达水平,分析eIF3b的表达水平与胃癌患者相关病理参数的相关性,评估其是否能作为胃癌的潜在诊断标志物。5.幽门螺杆菌感染对胃癌细胞中eIF3b表达的影响幽门螺杆菌Hp11637和Hp26695,按照MOI 1:100,感染胃癌细胞AGS,对照组加PBS,分别在幽门螺杆菌感染细胞后6h、12h和24h收取细胞,QRT-PCR检测各组中eIF3bmRNA表达水平;再用Hp11637和Hp26695,按照MOI 1:50、1:100和1:150分别感染AGS细胞,12h后收取细胞,QRT-PCR和Western blot分别检测各组中eIF3b的mRNA和蛋白表达水平。实验结果1.下调eIF3b的表达抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移QRT-PCR检测结果显示,eIF3b mRNA表达水平在胃癌细胞系SGC7901和MGC803中明显高于其它几种胃癌细胞系;用eIF3b特异性siRNA转染胃癌细胞SGC7901和MGC803,与转染的对照组(siRNA-negative control)相比,实验组中eIF3b mRNA和蛋白水平均明显下降。克隆形成实验结果显示,下调eIF3b的表达显著抑制胃癌细胞SGC7901和MGC803的克隆形成能力;CCK8细胞活力实验结果显示,下调eIF3b显著抑制SGC7901和MGC803的增殖能力;Transwell基质胶侵袭实验结果显示,下调eIF3b的表达显著抑制胃癌细胞SGC7901和MGC803的侵袭能力;Transwell迁移实验和细胞划痕实验结果显示,下调eIF3b的表达显著抑制胃癌细胞SGC7901和MGC803的迁移能力。2.下调eIF3b的表达在体内抑制了胃癌细胞的增殖和转移QRT-PCR 和 Western blot 检测 Lentivirus-eIF3b 可有效下调 SGC7901 细胞中eIF3b mRNA的表达水平。皮下注射胃癌细胞的裸鼠,5天后,对照组观察到较为明显的微小瘤体,9天后,开始测量瘤体大小,19天后处死裸鼠,瘤体的实体观察和生长曲线表明,与对照组相比,下调eIF3b的表达能抑制裸鼠体内瘤体的增殖。尾静脉注射胃癌细胞的裸鼠,两个月后处死,取出肺组织,经动物活体成像仪拍摄显示,对照组比实验组有更严重的肺部转移现象。肺组织实体观察和称重显示,对照组肿瘤结节数目多、体积大,肺的重量明显大于干扰组。肺部瘤体切片HE染色结果显示,在裸鼠肺部对照组比实验组癌细胞浸润明显。3.下调eIF3b的表达影响胃癌相关信号通路中重要基因的表达Western blot检测结果显示,下调eIF3b的表达,在SGC7901和MGC803细胞中抑制了与胃癌细胞增殖和转移相关的基因E2F1、CyclinD、CyclinE、Vimentin和β-catenin的蛋白表达水平,升高了抑癌基因p27的蛋白表达水平。ELISA结果显示,下调eIF3b的表达,抑制了 SGC7901细胞中IL-8的蛋白表达水平,升高了 MGC803细胞中IL-8的蛋白表达水平。表明下调eIF3b的表达可能通过对p27、E2F1、CyclinD、CyclinE、Vimentin、β-catenin 和 IL-8 的调控从而影响胃癌细胞的增殖和转移。拯救实验结果显示,下调eIF3b的表达对SGC7901和MGC803细胞增殖和迁移的抑制作用部分依赖于E2F1。4.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌组织标本中高表达QRT-PCR结果显示eIF3b mRNA在人慢性胃炎组织中的表达水平比在正常胃黏膜组织中的表达水平高,而且在Hp阳性(Hp+)胃炎组织中的表达水平比在Hp阴性(Hp-)胃炎组织中的表达水平高。QRT-PCR结果显示eIF3bmRNA在胃癌组织中的表达水平比在正常胃组织中的表达水平高,而且表达水平与胃癌患者的临床病理分期相关。免疫组化结果显示与癌旁正常组织相比,胃癌组织中eIF3b蛋白表达水平明显增高,而且eIF3b主要在细胞质中表达。5.幽门螺杆菌Hp11637和Hp26695能够上调胃癌细胞中eIF3b的表达水平QRT-PCR结果显示,Hp11637和Hp26695以MOI1:100感染胃癌细胞AGS,感染12h后AGS细胞中eIF3b的mRNA表达水平明显升高;幽门螺杆菌毒力因子CagA可明显上调AGS细胞中eIF3b的表达。Hp11637和Hp26695分别以MOI 1:50、1:100和1:150感染胃癌细胞AGS,感染12h后细胞中eIF3b的mRNA和蛋白表达水平逐渐上调。实验结论1.eIF3b能够通过调控肿瘤相关通路中的重要分子在体外促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。2.eIF3b在动物体内可以促进胃癌细胞的增殖和转移。3.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌组织中表达升高,且与胃癌的分期相关,提示eIF3b可能作为一种新的胃癌诊断标志物。4.幽门螺杆菌感染可上调胃癌细胞中eIF3b的表达,提示eIF3b可能参与幽门螺杆菌的致癌过程。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

山东大学硕士学位论文的相对分子质量为５５０－７００ＫＤａ，目前己确定的亚单位有１３（ｅＩＦ３ａ，ｅＩＦ３ｂ．．．ｅＩＦ３ｍ）邋［１５］。在真核细胞蛋白质翻译起始过程中，ｅＩＦ３结合０Ｓ核糖体亚基上，通过与ｅＩＦ４等其它亚基之间的相互作用促使４３Ｓ核糖体合物前体的形成［１６］；邋ｅＩＦ３还参与对重起始的扫描以及对起始密码子ＡＵＧ的别过程［１７］。研究发现，ｅｌＫ的许多亚基如ｅＩＦ３ａ、ｅＩＦ３ｂ、ｅＩＦ３ｅ、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｈｅＩＦ３ｉ在肿瘤中均有异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关［１８］。组成ｅＩＦ３个亚基既可以从完整的ｅＩＦ３复合物的角度在蛋白质合成调控中发挥作用［１９］，逡逑而对肿瘤的发生发展产生影响［２０］，也能单独地通过其他方式发挥各亚基其面的作用而调控基因的表达［２１］。因此，研宄ｅＩＦ３复合物中各个亚基在肿瘤发展过程中的功能以及作用发挥的分子机制至关重要，可以为肿瘤的诊断治以及预后提供依据。逡逑

山东大学硕士学位论文通过激活Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路促进癌症的进，ｅＩＦ３ｂ被推测可作为肾癌的诊断标志物结构及功能有一定的了解，但ｅＩＦ３ｂ是否在因此，本实验将从研宄ｅＩＦ３ｂ在胃癌细胞增探讨ｅＩＦ３ｂ在胃癌发生发展过程中的作用。逡逑ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑ｓｕｕｎｉｔｓ逡逑

山东大学硕士学位论文实验结果逡逑系中ｅ邋Ｉ邋Ｆ３ｂ的表达及特异性ｓ邋ｉ邋ＲＮＡ干扰效率的检测逡逑Ｒ检测胃上皮细胞永生化细胞ＧＥＳ－１和ＡＧＳ、ＳＧＣ７９０１、ＭＧＣ２７五种不同胃癌细胞中ｅＩＦ３ｂ邋ｍＲＮＡ的表达水平，结的胃癌细胞ＳＧＣ７９０１和ＭＧＣ８０３中ｅＩＦ３ｂ邋ｍＲＮＡ表达＊＊＊ｐ＜０．００１），具有统计学意义。因此我们选择用ＳＧＣ７后续细胞功能实验的研宄对象。逡逑１５－１逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 Shiu-Wan Chan;;Establishment of chronic hepatitis C virus infection:Translational evasion of oxidative defence[J];World Journal of Gastroenterology;2014年11期

2 Ko Eun Lee;Pham Ngoc Khoi;Yong Xia;Jung Sun Park;Young Eun Joo;Kyung Keun Kim;Seok Yong Choi;Young Do Jung;;Helicobacter pylori and interleukin-8 in gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2013年45期

本文编号：2765206