Id3表达通过下调β-catenin影响结肠癌细胞SW480生物学作用的研究

发布时间：2020-07-22 05:05

【摘要】：研究背景:肠癌是目前导致人类死亡的第三大恶性疾病,在由癌症引起的死亡原因中排第二位。尽管最近研发了几种新的肠癌病人的治疗方法,但是对于肠癌晚期病人的临床疗效仍不甚理想,肿瘤转移仍是肠癌病人死亡的最重要原因。尽管我们在肠癌的治疗方法上取得了巨大成功,但肠癌的总体死亡率仍接近40%。手术是最基本的治疗手段,然而仍有30%到50%的Ⅰ到Ⅲ期的肿瘤病人会在后续五年的治疗中复发。此外,由于内源性或外源性导致的耐药性的产生,奥沙利铂或5-氟尿嘧啶这样最常见的抗癌药已经不能对结肠癌发挥有效作用,甚至对其产生了药物抵抗。目前研究认为,Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是导致肠癌肿瘤形成和预后至关重要的因素之一。研究证实Wnt/β-catenin信号通路在细胞分化和增殖、器官形成、胚胎发育、及肿瘤发生中都发挥重要作用。β-catenin是Wnt信号通路的关键分子,Wnt/β-catenin信号通路的特点是β-catenin的积聚和核定位。胞浆内的 β-catenin 受腺瘤病蛋白(adenomatosis polyposis coli,APC)、轴蛋白(Axin)、蛋白磷酸酶 2A(protein phosphatase 2A,PP2A)、糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)和酪蛋白激酶 1α(casein kinase 1α,CK1α)组成的降解蛋白复合物的调控。当Wnt信号通路被激活时,β-catenin从降解复合物中释放出来并转移到核内,与T细胞因子/淋巴增强因子转录因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)家族一起激活特定的下游 Wnt靶基因如c-myc、cyclinDl和COX等。Wnt信号异常的肿瘤都存在β-catenin表达水平上调,因此靶向β-catenin的治疗越来越引起广泛关注。分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id),属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)转录因子家族成员,对碱性 HLH(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子活性起负调节作用。Id分子是胚胎形成过程中的必要因子,它们在细胞增殖、分化和生长过程中发挥重要的功能。目前共发现4种Id分子,即Id1、Id2、Id3和Id4。Id3蛋白属于四种同源蛋白家族之一,近年来的研究表明,Id3在肿瘤细胞生长、分化、凋亡、侵袭、转移和信号转导等方面都发挥重要的调控作用。本实验室前期研究发现,Id3 mRNA及蛋白在人肺腺癌细胞株(A549)细胞和A549细胞耐药株(A549/DDP)细胞中均呈低水平的表达,过表达Id3可抑制A549和A549/DDP细胞的增殖、促进其凋亡。此外还发现Id3还可逆转A549/DDP对顺铂的耐药性。最近有研究发现,Id3可以通过调节β-catenin的mRNA和蛋白的水平来促进角质细胞凋亡、影响角质细胞增殖,然而关于Id3对肠癌细胞中β-catenin的表达调控机制尚未见研究报道。本研究按以下三部分进行:第一部分:Id3及β-catenin mRNA在不同肿瘤细胞中的表达分析目的:主要研究Id3与β-catenin mRNA在不同肿瘤细胞中的表达水平方法:采用Trizol法提取各肿瘤细胞系总RNA,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析肿瘤细胞中Id3和β-catenin mRNA的相对表达量。结果:Id3 mRNA在不同恶性肿瘤细胞系中有不同程度的表达,在肠癌细胞株SW-480及HT-29中表达量最低;而β-catenin在SW-480细胞中的表达水平显著高于其他恶性肿瘤细胞。结论:Id3和β-catenin在不同的肿瘤细胞中有不同的表达水平;β-catenin在肠癌细胞中的异常高表达可能是引起肠癌的重要因素之一。第二部分:Id3过表达对肿瘤细胞中β-catenin表达水平的影响目的:本文主要研究Id3基因过表达对三种肿瘤细胞中β-catenin表达的影响。方法:采用脂质体转染技术将含人Id3基因的真核表达载体Id3/pEGFP分别导入肠癌细胞(SW-480)、人肺腺癌细胞(A549)和人肺腺癌细胞耐顺铂株(A549/DDP)三种细胞,荧光显微镜观察细胞内Id3-EGFP融合蛋白的表达情况;qRT-PCR技术分析转染后细胞内Id3及β-catenin的mRNA表达水平;Western blot分析转染后细胞内Id3及β-catenin蛋白的表达水平。结果:在Id3过表达的肠癌细胞SW-480中,β-catenin表达水平明显下调,与空载体对照组比较表达水平有显著性差异(p0.01);而在A549和A549/DDP细胞中,Id3过表达对β-catenin的表达水平与空载体对照组比较均无显著差异(p0.01)。结论:外源性转染Id3基因可明显下调肠癌SW-480细胞中β-catenin的表达,有望为肠癌靶基因治疗提供新思路。第三部分:Id3过表达对肠癌SW-480细胞增殖、凋亡、及迁移的影响目的:Id3是在多种肿瘤细胞中影响细胞的增殖、迁移及调节细胞的周期进程。本研究主要探讨Id3基因过表达对肠癌SW-480细胞生物学活性的影响。方法:分别采用CCK-8法和流式细胞术检测真核表达载体Id3/pEGFP转染SW-480细胞后的细胞增殖和凋亡情况;采用全息成像技术检测细胞迁移功能。结果:外源性Id3表达除可明显抑制肠癌细胞的增殖、促进其凋亡外,还可抑制SW-480细胞的迁移,提示Id3可能是一种肠癌负调控因子。结论:以上结果表明Id3可能在肠癌发生发展中可能发挥肿瘤抑制基因的作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.3
【图文】：

过表达,细胞增殖

４．１逦Ｉｄ３过表达抑制ＳＷ－４８０细胞的增殖。ＳＷ－４８０细胞分成ｐＥＧＦＰ／Ｉｄ３过表达组、逡逑ｐＥＧＦＰ空载体组及空白细胞对照组三组。ＣＣＫ－８法检测细胞增殖结果显示，ｐ逡逑Ｉｄ３／ＥＧＦＰ过表达可明显抑制ＳＷ－４８０细胞增殖（Ｐ＜０．０５；图３－丨），表明Ｉｄ３在逡逑ＳＷ－４８０细胞中发挥肿瘤抑制功能。逡逑２．２逡逑２邋０逦Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑４邋ａ邋．逦－0－邋ｐＥＧＦＰ／ｋｔｔ逦Ａ逡逑ｒｙ逡逑０．０邋逦逦逦逦逦．逦．逦逡逑Ｏｄａｙ逦１ｄａｙ逦２ｄａｙ逦３ｄａｙ逡逑图３－ｌ过表达Ｉｄ３抑制ＳＷ－４８０细胞增殖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆＩｄ３邋ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ＳＷ－４８０邋ｃｅＩｌｓ．＊＿Ｐ＜０．０５．逡逑４．２逦Ｉｄ３过表达促进ＳＷ－４８０细胞凋亡。流式细胞术结果表明，与空载体转染组相逡逑比，Ｉｄ３过表达组ＳＷ－４８０细胞凋亡率明显增高（图３－２）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ＴＴ逦了逡逑逦逦邋°１逡逑ｔｉｌ—邋ｔｉｌ：；邋＾逡逑ｐＥＧＦＰ逦ｋＪ３／ＤＥＧＦＰ逡逑Ｃ逡逑２０邋－逡逑ｐＥＧＦＰ逦Ｉｄ３／ｐＥＧＦＰ逡逑３１逡逑

细胞迁移,全息成像,过表达

逡逑图３－２邋ｌｄ３诱导ＳＷ－４８０细胞凋亡逡逑Ａ：邋ｐＥＧＦＰ转染组Ｂ：邋ｐＥＧＦＰ／Ｉｄ３转染组Ｃ：直方图显示细胞凋亡比例逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｉｄ３邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ＳＷ－４８０邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ａ：邋ｐＥＧＦＰ－邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｇｒｏｕｐ邋Ｂ：邋ｐＥＧＦＰ／Ｉｄ３－邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｃ：邋Ｔｈｅ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋ａｐｏｐｔｏｔｉｃ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｗｉｔｈ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ．邋＊Ｐ＜０．０５．逡逑４．３邋１ｄ３过表达抑制ＳＷ－４８０细胞迁移。全息成像数据显示（图３－３Ａ），邋２４ｈ－３０ｈ的逡逑ｐＥＧＦＰ／ｌｄ３过表达组肿瘤细胞的迁移速度和距离明显小于空载体组和空白细逡逑胞组细胞（图３－３）。这些结果显示丨ｄ３过表达可降低ＳＷ－４８０细胞的迁移能力。逡逑Ａ逡逑ＷＢ逡逑Ｂ逦Ｃ逡逑丨ｉ邋NB逡逑Ｏｈ邋６ｈ邋１２ｈ逦１８ｈ逦２４ｈ逦３０ｈ逦0邋逦＾逦逦，逦，逦，逦，逦逡逑Ｏｈ邋６ｈ邋１２ｈ逦１８ｈ逦２４ｈ逦３０ｈ逡逑图３－３邋Ｉｄ３抑制ＳＷ－４８０细胞迁移逡逑Ａ：全息成像图Ｂ：细胞迁移速度Ｃ：细胞迁移距离逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ｉｄ３邋ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＷ－４８０邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ａ：邋ｄｉｇｉｔａｌ邋ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋Ｂ：邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｔｉｌｉｔｙ邋ｓｐｅｅｄ邋Ｃ：邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｔｉｌｉｔｙ邋ｄｉｓｔａｎｃｅ．邋＊尸＜０．０５．逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－４邋Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邋ｂ

【参考文献】