Galectin-4调控肺腺癌细胞侵袭转移机制研究

发布时间：2020-07-22 12:15

【摘要】：研究背景与目的肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康和生命。肺癌不仅发病率和死亡率高,而且恶性转移高,预后较差。因此,寻找肺癌侵袭转移的标志物以及靶向治疗的靶点是治疗肺癌的新策略。半乳糖凝集素-4(galectin-4)是半乳糖凝集素家族中的一个串联重复型成员,拥有两个相似的糖识别域(carbohydrate cognition domain,CRD)。Galectin-4 在细胞内,细胞表面及循环中都有表达,可调节细胞增殖、分化、凋亡及黏附。已有研究表明在结直肠癌和胰腺癌中galectin-4参与调控肿瘤的侵袭转移过程,在肺腺癌中,galectin-4的高水平表达是转移的独立预测因子,与临床不良预后有关。然而galectin-4在肺腺癌侵袭转移中的调控机制尚未有文献报道。本课题拟揭示在肺腺癌A549细胞和H1299细胞中galectin¨4与侵袭转移的关系,并探讨潜在的分子机制。实验方法和结果实验方法:1.检测细胞内galectin-4对肺腺癌细胞侵袭转移能力以及与血管内皮细胞粘附的影响本论文选用了高表达galectin-4的肺腺癌A549细胞和H1299细胞作为研究对象,首先采用siRNA技术干扰A549细胞和H1299细胞内galectin-4的表达,采用Western blot方法检测galectin¨4的表达情况。干扰细胞内galectin-4后,采用划痕实验、黏附实验和Transwell实验检测galectin-4对A549细胞和H1299细胞的黏附、侵袭转移能力的影响。2.检测galectin-4对黏附分子以及侵袭转移相关蛋白表达的调节作用为探究galectin-4调控肺腺癌细胞粘附、侵袭转移的作用机制,采用Western blot方法检测siRNA干扰galectin-4表达后A549细胞和H1299细胞内黏附分子E-cadherin、N-cadherin、ICAM-1 和 CD44,侵袭转移相关蛋白 EGFR、MMP-2和p-FAK表达的变化。为进一步揭示galectin-4是如何调控这些蛋白的表达,检测了 galectin-4对转录因子β-catenin、NF-κB、p-STAT3表达的影响,同时使用p-STAT3抑制剂HO-3867和NF-κB抑制剂PDTC来研究NF-κB和p-STAT3二者在信号通路中的上下游关系。3.确定galectin-4调控肺腺癌细胞侵袭转移的分子机制NF-κB和β-catenin是两个重要的转录调控因子,为探究两者对肺腺癌细胞内E-cadherin、N-cadherin、CD44 和 MMP-2 的调节作用,采用 NF-κB 抑制剂 PDTC和β-catenin抑制剂ICG-001后检测上述蛋白的表达水平。同时,采用NF-κB抑制剂PDTC和β-catenin抑制剂ICG-001以及galectin-4 siRNA处理细胞后,通过划痕实验、黏附实验和Transwell实验进一步验证NF-κB和β-catenin在galectin-4调控肺腺癌细胞侵袭转移中的作用,再通过Western blot方法进一步验证二者对galectin-4调控细胞侵袭转移相关分子的转录调控作用。实验结果:1.细胞内galectin-4影响肺腺癌细胞侵袭转移能力以及与血管内皮细胞的黏附Western blot结果显示,干扰galectin-4能降低A549细胞和H1299细胞内galectin-4的表达。划痕实验、黏附实验和Transwell实验结果表明干扰galectin-4之后,A549细胞迁移速度加快,侵袭能力增强,对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的黏附能力增强。干扰galectin-4之后,H1299细胞迁移受到抑制,侵袭能力减。弱,对HUVECs的黏附能力减弱。说明细胞内galectin-4抑制A549细胞的侵袭转移,促进H1299细胞的侵袭转移。2.Galectin-4调节黏附分子以及侵袭转移相关蛋白的表达Western blot结果表明,在A549细胞中,干扰galectin-4后,黏附分子E-cadherin的表达量减少,N-cadherin和CD44表达量增加,即galectin-4能通过调控黏附分子E-cadherin、N-cadherin和CD44来抑制A549细胞的黏附。在H1299细胞中,干扰galectin-4后,黏附分子N-cadherin和CD44表达量减少,干扰前后细胞内E-cadherin均不表达。说明galectin-4能通过上调N-cadherin和CD44来促进H1299细胞的黏附。在A549细胞中,galectin-4还能下调侵袭转移相关蛋白MMP-9的表达,在H1299细胞中,galectin-4能上调MMP-2和EGFR的表达。说明EGFR和MMP-2同样参与galectin-4调控的侵袭转移过程。在两种细胞中,galectin-4并不调控ICAM-1和p-FAK蛋白的表达。此外,我们发现galectin¨4影响转录因子β-catenin、NF-κB、p-STAT3的表达。黏附分子和侵袭转移相关蛋白可能受这些转录因子的调控。对NF-κB和p-STAT3在信号通路中的上下游调控关系研究结果显示,加入p-STAT3抑制剂HO-3867能显著抑制NF-κB的表达,而加入NF-κB抑制剂PDTC对p-STAT3的表达没有影响。这说明NF-κB受p-STAT3调控,但不调控p-STAT3,即NF-κB位于p-STAT3的下游。3.Galectin-4调控肺腺癌细胞侵袭转移的分子机制加入 NF-κB 和β-catenin 抑制剂后,E-cadherin、N-cadherin、CD44 和 MMP-2的表达发生变化,表明 NF-κB 和β-catenin 调控 E-cadherin、N-cadherin、CD44和MMP-2的表达。因此我们推测,galectin-4是通过p-STAT3/NF-κB和β-catenin调控E-cadherin、N-cadherin、CD44和MMP-2的表达来影响细胞的侵袭转移。划痕实验、黏附实验和Transwell实验结果表明,在PDTC和ICG-001存在的情况下,肺腺癌细胞的迁移、黏附和侵袭均受到抑制。即galectin-4是通过调控NF-κB和β-catenin来影响肺腺癌细胞的黏附、侵袭转移。进一步的蛋白表达水平检测结果显示,galectin-4是通过调控NF-κB和β-catenin来调节E-cadherin、N-cadherin、CD44和MMP-2的表达。综上,galectin-4通过调节转录因子p-STAT3/NF-κB 和β-catenin 调控 E-cadherin、N-cadherin、CD44 和 MMP-2 的表达,从而影响肺腺癌细胞的侵袭转移。实验结论1.细胞内galectin-4抑制A549细胞迁移、黏附和侵袭,促进H1299细胞迁移、黏附和侵袭。2.在 A549 细胞中,galectin-4 通过下调β-catenin 减少 N-cadherin、CD44 和 MMP-2的表达,增加E-cadherin的表达,下调p-STAT3/NF-κB减少N-cadherin和CD44的表达来抑制细胞侵袭转移。在H1299细胞中,galectin-4通过上调β-catenin和p-STAT3/NF-κB增加N-cadherin、CD44和MMP-2的表达来促进细胞侵袭转移。两条通路中,β-catenin的作用优于p-STAT3/NF-KB。3.在H1299细胞中,galectin-4能上调EGFR的表达,但不促进EGFR进入胞浆。而在A549细胞中,galectin-4并不能影响EGFR的表达,EGFR可能是两种细胞中galectin-4发挥相反作用的一个重要调控因子。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

【相似文献】