TRPM7对乳腺癌增殖、侵袭、转移的影响及其机制研究

发布时间：2020-07-22 14:03

【摘要】：研究背景:恶性肿瘤是威胁人类健康最主要疾病之一,其发病率呈逐年递增趋势,其中乳腺癌是为女性发病率最高的恶性肿瘤,全球乳腺癌每年新发病例为 100多万,其中死亡例数为40多万。乳腺癌也是中国女性最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率也在逐年升高,因此乳腺癌在全球范围内被广泛研究。虽然乳腺癌是当今研究的热点之一,但因其发病机制复杂,现在还没有特效的方法根治。深入研究其发病机制为临床提供新的治疗靶点,成为亟待解决的问题。瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道绝大多数是一种阳离子非选择性通道,由六次跨膜的α螺旋结构域和胞内的N末端和C末端组成,并由第五第六跨膜结构域构成孔道区。TRP通道形成功能性同聚四聚体或异聚四聚体,在信号转到中发挥作用。近年来的研究发现TRP通道家族和胃癌、前列腺癌、白血病及淋巴瘤等多种恶性肿瘤相关。TRPM7(transient receptor potential malestatin7)属于LTRP亚族,同时具有蛋白激酶结构和阳离子通道结构。有文献报道TRPM7在肺癌、膀胱癌以及乳腺癌中存在高表达,并与细胞增殖和转移相关。近年来的研究表明,包括乳腺癌在内的肿瘤组织内存在一小部分致瘤能力特别强,分化程度极低的细胞,具有干细胞的自我更新及多向分化特性,称为“肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)”。肿瘤干细胞在启动肿瘤形成和生长中发挥着决定性的作用,是导致肿瘤复发、转移及化疗耐药的根源。体内外实验都表明,乳腺肿瘤干细胞对放化疗都有抗药性。传统的肿瘤治疗针对的是普通肿瘤细胞,却无法从根本上消灭肿瘤干细胞,治疗后肿瘤干细胞重新形成肿瘤组织并导致肿瘤复发和转移。更有效的肿瘤治疗需要在清除普通肿瘤细胞的同时也清除肿瘤干细胞。因而新的治疗手段和新靶标的发现迫在眉睫,是近年来恶性肿瘤治疗的研究热点。TRPM7是否在乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭过程中发挥重要功能,是否对乳腺癌干细胞有调控作用,从而影响乳腺癌对化疗药物的耐受,还未见文献报道。目的:研究TRPM7对乳腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭等功能的影响,并探讨可能的调控机制。方法:本研究采用 QPCR、Western blot、免疫组化验证 TRPM7 在乳腺癌组织以及乳腺癌细胞的mRNA 和蛋白表达。施加特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA和TRPM7非特异性离子通道抑制剂2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-APB)处理细胞,利用MTT、transwell以及划痕愈合等实验研究TRPM7对乳腺癌细胞的功能影响。流式细胞术用于检测细胞周期以及乳腺肿瘤干细胞的变化。Western blot用于检测相关信号通路的改变。比较两种抑制剂作用后相关功能及信号通路变化,明确TRPM7双活性蛋白的具体功能差异。结果: 1、TRPM7在乳腺癌组织中高表达,TRPM7在化疗后乳腺癌组织中表达升高,并且TRPM7的高表达与乳腺癌病人较差的预后有相关性。收集乳腺癌组织标本,使用免疫组化检测乳腺癌组织及其相对应癌旁正常组织中TRPM7的表达,发现乳腺癌组织中表达高于癌旁正常组织,QPCR结果显示乳腺癌组织TRPM7的mRNA高于癌旁正常组织;QPCR检测同一患者化疗前后乳腺癌组织中TRPM7 的mRNA表达,显示化疗后乳腺癌组织TRPM7的mRNA表达高于化疗前。同时进一步检索数据库发现,高表达TRPM7的乳腺癌患者总体生存情况差。 2、抑制TRPM7蛋白表达能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭。使用慢病毒转染体系建立稳定抑制TRPM7蛋白表达(特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA)的乳腺癌MDA-MB-231细胞系和乳腺癌MCF7细胞系。MTT实验发现,特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖能力,但无明显抑制乳腺癌MCF7细胞的增殖能力;划痕修复实验以及transwell小室实验分别显示特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。 3、特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞发生细胞周期阻滞、凋亡增加以及MET过程。流式细胞术检测细胞周期发现,特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞后细胞出现了G1期阻滞以及出现凋亡增加,从而影响了增殖能力。 Western blotting结果显示,vimentin表达降低,E-cadherin表达升高,出现了典型的EMT过程,从而降低了细胞的迁移和侵袭能力。 4、TRPM7在乳腺癌MDA-MB-231细胞干细胞中高表达,特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞会下调乳腺癌干细胞比例,从而增强乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。使用ALDEFLUOR检测分选乳腺癌MDA-MB-231细胞的干细胞,并对其进行QPCR检测,发现TRPM7在ALDH+乳腺癌干细胞亚群中mRNA表达升高;同时结果显示特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA能够降低乳腺癌MDA-MB-231细胞中ALDH+乳腺癌干细胞的比例。施加紫杉醇化疗药物处理,发现特异性抑制TRPM7蛋白表达的shRNA抑制组乳腺癌MDA-MB-231细胞呈现出较高的化疗敏感性,另外相比对照组,抑制组化疗后的ALDH+肿瘤干细胞比例明显下降。 5、特异性抑制TRPM7蛋白表达著影响STAT3和AKT信号通路。使用Western blot 检测细胞内主要信号通路的磷酸化情况,结果显示特异性抑制TRPM7蛋白表达显著降低乳腺癌MDA-MB-231细胞 STAT3和AKT的磷酸化水平。推测TRPM7可能通过这两条信号通路调节肿瘤干细胞。 6、抑制TRPM7离子通道活性能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭,周期阻滞、凋亡增加以及下调乳腺肿瘤干细胞比例,但只影响AKT信号通路。使用TRPM7非特异性离子通道抑制剂2-APB处理乳腺癌MDA-MB-231细胞,重复之前的功能实验,结果显示抑制TRPM7离子通道活性能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭,周期阻滞、凋亡增加以及下调乳腺癌MDA-MB-231细胞干细胞比例,趋势与特异性抑制TRPM7蛋白表达结果一致,但除了增殖抑制,其余程度均不如特异性抑制TRPM7蛋白表达。信号通路方面则仅抑制AKT通路,可能对STAT3无作用。结论:(1)TRPM7在乳腺癌中高表达,与乳腺癌的发生发展以及预后有显著相关性;(2)特异性抑制TRPM7蛋白表达能够通过下调乳腺癌MDA-MB-231细胞干细胞比例、发生G1期阻滞、发生MET过程及降低磷酸化STAT3和磷酸化AKT蛋白水平从而抑制乳腺肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力;(3)特异性抑制TRPM7蛋白表达能够下调乳腺癌MDA-MB-231细胞的干细胞比例,并增强乳腺癌MDA-MB-231细胞对紫杉醇的敏感性;(4)TRPM7主要通过STAT3和AKT信号通路发挥功能;(5)TRPM7离子通道活性参与大部分乳腺癌MDA-MB-231细胞功能的调节,但只影响AKT通路,STAT3通路可能只受激酶活性调控。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

乳腺癌组织,mRNA表达量,乳腺癌

癌[37]、食管癌[38]、鼻咽癌[39]、胰腺癌[40]且和相关恶性肿瘤的增殖、侵袭及转移正相关报道，乳腺癌化疗前后组织中 TRPM7 的表达尚未RPM7 在乳腺癌组织中高表达，TRPM7 在乳腺癌化NA 在乳腺癌组织表达高于癌旁正常组织 M7 在乳腺癌组织中的表达情况，收集了 16 例乳旁正常组织，使用荧光定量 PCR 分析在乳腺癌M7 的 mRNA 的表达量：使用 Trizol 提取总 mRNA显示，乳腺癌组织中 TRPM7 的 mRNA 表达量高于

乳腺癌组织,mRNA表达量,化疗后

安徽医科大学博士学位论文PM7 的 mRNA 在乳腺癌化疗后组织表达高于乳腺癌化疗前组了解 TRPM7 在乳腺癌组织化疗前后的表达情况，收集了 8 例乳腺癌组织，使用荧光定量 PCR 检测在乳腺癌病人化疗前后的乳腺癌的表达量：使用 Trizol 提取总 mRNA 后进行了荧光定量 PCR 检测。乳腺癌组织中 TRPM7 的 mRNA 表达量明显高于化疗前（图 2）。这一发生过程中可能扮演着重要角色，并且随着乳腺癌化疗而表达升高的化疗耐药有一定相关性。

乳腺癌组织,蛋白表达,预后,相关性

38 图 3：乳腺癌组织中 TRPM7 蛋白表达高于癌旁正常组织。 N 代表癌旁正常组织，M 代表乳腺癌癌组织，28 及 25 为组织编号 Fig 3： TRPM7 protein expresses higher in breast cancer tissues than paratumor normal tissues. N instead for paratumor normal tissues, M instead for cancer tissues. indicates statistical significance . 3.2 TRPM7 表达与乳腺癌患者的预后情况相关性分析基于以上实验结果及 TRPM7 与多种恶性肿瘤的相关性，推测 TRPM7 与乳腺癌患者的预后间存在一定的相关性，于是在 The Cancer Genome Atlas（TCGA）中检索 TRPM7 与患

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