塞来昔布对结肠癌干细胞中β-catenin及干性和分化程度影响

发布时间：2020-07-23 18:25

【摘要】：目的:探讨非甾体抗炎药塞来昔布作用于结肠癌干细胞,通过调控Wnt信号通路中β-catenin从而对其“干性”、分化程度的影响及可能存在的机制。方法:1.流式分选HT-29和SW480得到CD133~+/CD44~+双标的的结肠癌干细胞后进行悬浮培养;2.采用CKK8法检测塞来昔布对CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞增殖的影响,并且选取合适的药物浓度梯度。3.TUNEL实验检测塞来昔布干预后对CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞晚期凋亡的影响;4.塞来昔布干预CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞后,观察其对细胞成球能力的影响。5.塞来昔布干预CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞后,观察其对克隆形成能力的影响。6.用塞来昔布处理CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞后,用PCR法检测重要干性标志物Lgr5、Sox2和分化标志物Vilin、Muc2以及β-catenin在mRNA水平的表达7.进一步用Western-Blot检测Lgr5、Muc2以及β-catenin、磷酸化的β-catenin蛋白水平的表达。结果:(1)CCK-8结果显示不同浓度的塞来昔布(5、10、20、40μmol/L)作用于一定时间(24h、48h、72h)后,与对照组相比,塞来昔布呈剂量和时间依赖性地抑制CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞增殖(p0.05)。(2)TUNEL实验中显示在20μmol/L塞来昔布作用于CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞可诱导其晚期凋亡。(3)成球实验显示,20μmol/L塞来昔布作用CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞10天后,CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞成球数量和体积明显地降低(p0.05)。(4)克隆形成实验显示,用20μmol/L塞来昔布处理后14天后,CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞克隆形成能力明显地降低(p0.05)。(5)PCR法检测干性指标Lgr5、Sox2在mRNA水平的表达下调,分化指标Muc2、Villin在mRNA水平的表达上调,以及β-catenin在mRNA水平的表达下调、磷酸化的β-catenin在mRNA水平的表达上调(p0.05)。(6)Western-Blot发现干性指标Lgr5蛋白水平的表达下调,分化指标Muc2在蛋白水平的表达上调,以及β-catenin在蛋白水平的表达下调、磷酸化的β-catenin在蛋白水平的表达上调(p0.05)结论:(1)塞来昔布能够有效地抑制结肠癌干细胞的增殖和诱导其凋亡。(2)塞来昔布处理后的结肠癌干细胞,可降低Wnt信号通路中β-catenin表达、增加磷酸化β-catenin的表达,其下游靶标干性标志物Lgr5和Sox2的表达均降低,在行为学行上其成球能力和克隆形成能力也明显的降低,说明塞来昔布可在一定程度上抑制结肠肿瘤干细胞的“干性”。(3)塞来昔布作用结肠癌干细胞后,可使其分化指标Muc2和Villin的表达增加,说明塞来昔布具有促进结肠癌干细胞向成熟分化的能力。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.35
【图文】：

遵义医学院硕士学位论文 朱生琳2 结果2.1 流式分选 CD133+/CD44+获得结肠癌干细胞通过流式分选仪双标抗体 CD133、CD44 分选出目的细胞 CD133+/CD44+HT-29 和CD133+/CD44+SW480 结肠癌干细胞,根据 CD133、CD44 抗体结合结肠癌干细胞的表面标志物的原理将其标记流式分选仪筛选出来（图 1）。

细胞增殖的影响CCK-8 是测定细胞增殖实验中活细胞数目的一种高敏度、无放射性的比色检测法。CCK8 检测细胞增殖、细胞毒性试验的灵敏度比 MTT、XTT、及 MTS 更高，数据可靠，重复性好，操作简便，对细胞几乎没有毒性。CCK8 中含有 WST-8,是一种更新的水溶性四唑盐。水溶性四唑盐在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈良好线性关系。本实验用 CCK细胞增殖技术检测塞来昔布对结肠癌干细胞增殖的影响，CCK-8 结果显示：2,5-Dimethyl-celecoxib 分别作用结肠癌干细胞 HT-29、SW480 24h、48h、72h 后2,5-Dimethyl-celecoxib 浓度从 5μmol/L 到 40μmol/L,随着浓度的增加，其对结癌干细胞的增殖抑制作用越明显（p＜0.05）。因此，2,5—Dimethyl-celecoxib 呈现时间和剂量依赖性地抑制结肠癌干的增殖（图 2，表 1，表 2）。

图 3：TUNEL 实验检测 2,5—Dimethyl-celecoxib 对结肠癌干细胞 SW480 和 HT-29 晚期凋亡的影响。2.4 塞来昔布对结肠癌干细胞成球能力的影响肿瘤干细胞成球能力是鉴定肿瘤干细胞的一个重要方法，并且可以判断其单个细胞肿瘤干细胞在适宜条件中的自我更新的能力，一般用细胞球形成效率表示。本实验通过 20μmol/L 塞来昔布干预结肠癌干细胞后发现其成球能力体积和数量上显著降低(图 4,表 3）

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 宣自学;袁守军;周育成;方晴霞;;姜黄素靶向结肠癌干细胞的作用及机制研究进展[J];中国肿瘤;2017年05期

2 周瑞莲;姚程;陈玉丙;;结肠癌干细胞的研究进展[J];中国生物制品学杂志;2008年03期

3 ;BMC Complem Altern M:来自葡萄的化合物可杀死结肠癌干细胞[J];现代生物医学进展;2017年27期

4 陈方军;刘玉兰;张育军;孙国平;;结肠癌干细胞特征及生物学行为研究进展[J];中国老年学杂志;2016年11期

5 张东兴;颜登国;;结肠癌干细胞蛋白表达及生物学特性:培养与筛选分析[J];中国组织工程研究;2015年45期

6 张泽锋;王启仪;沙卫红;;结肠癌干细胞标记物研究进展[J];胃肠病学;2016年05期

7 陈方军;刘玉兰;张育军;孙国平;;结肠癌干细胞生物学特性研究进展[J];第二军医大学学报;2014年11期

8 苏沐;张全安;;无血清培养联合化疗药物对人结肠癌干细胞作用的初步研究[J];实用临床医药杂志;2012年21期

9 尹晓玲;陈应果;张建红;周先云;陈华俊;赵银晶;梁后杰;;人IL-12对结肠癌干细胞生物学特性的影响及其机制[J];第三军医大学学报;2013年12期

10 陈志刚;黄建;;结肠癌干细胞研究进展[J];实用肿瘤杂志;2010年01期

相关会议论文 前1条

1 倪瑶瑶;蔡凯;孙佳楠;王雅倩;李淼;郭梅;窦骏;;下调Hotair表达对结肠癌干细胞侵袭转移性和致瘤性影响[A];第九届全国免疫学学术大会论文集[C];2014年

相关博士学位论文 前5条

1 翁丁虎;单克隆抗体的两种~(131)I标记方法比较及靶向结肠癌干细胞放射免疫治疗的实验研究[D];华中科技大学;2017年

2 王荣;PRDX2对结肠癌干细胞特性的调控作用及机制研究[D];重庆医科大学;2017年

3 冷政伟;KLF4在富集结肠癌干细胞的球细胞中发挥原癌作用[D];华中科技大学;2013年

4 刘烁;FOXP3对结肠癌干细胞自我更新的影响及其机制研究[D];第四军医大学;2017年

5 方砚田;结肠癌干细胞分选、差异microRNA表达谱检测以及miR-449b-CCND1、E2F3通路在结肠癌干细胞自我更新的机制研究[D];复旦大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 朱生琳;塞来昔布对结肠癌干细胞中β-catenin及干性和分化程度影响[D];遵义医学院;2018年

2 万丽娟;晚期糖基化终末产物对结肠癌干细胞增殖凋亡的影响及机制研究[D];安徽医科大学;2018年

3 张群慧;网膜素-1对结肠癌干细胞增殖凋亡的影响及机制研究[D];安徽医科大学;2017年

4 赵媛媛;RNAi沉默Nanog基因对人结肠癌干细胞生物学行为的影响[D];吉林大学;2017年

5 宫萍;甲硫哒嗪对人结肠癌干细胞的作用研究[D];吉林大学;2015年

6 徐媛媛;结肠癌干细胞的筛选及其耐药性研究[D];吉林大学;2010年

7 周宁;结肠癌干细胞抗原致敏的树突状细胞诱导抗肿瘤免疫应答的研究[D];吉林大学;2015年

8 时珊珊;结肠癌干细胞的gp96冲击的DC-CIK对同源细胞的杀伤及gp96生物质谱研究[D];天津医科大学;2017年

9 韩博;20（S）-人参皂苷Rg3诱导结肠癌干细胞凋亡及其机制的初步研究[D];吉林大学;2013年

10 于杰;负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源肿瘤干细胞杀伤作用的初步研究[D];天津医科大学;2015年

本文编号：2767679