KIAA0247通过Notch通路抑制非小细胞肺癌增殖，转移和侵袭的研究

发布时间：2020-07-23 22:49

【摘要】：目的:肺癌,是目前世界上诊断率第二高的癌症,也是全世界所有癌症相关死亡的主要原因,肺癌的发病率也在呈现稳步上升趋势。大约有百分之八十五到百分之九十的肺癌患者被诊断为非小细胞肺癌。目前为止,在可行的情况下,外科手术是治疗非小细胞肺癌的最佳治疗策略,然而,即使患者接受了最及时的外科手术治疗达到治愈,也可能会发生局部的,或者是全身系统性的转移并且最终死于肺癌。肺癌的转移和侵袭,与肺癌的死亡率直接相关,而肺癌的转移和侵袭主要与一些关键基因的转录调控相关,因此,发现癌症相关基因,以及揭示这些基因的功能在治疗肺癌中十分重要。Notch信号通路在发育,细胞增殖,细胞分化和细胞凋亡方面的作用已经有很多报道,一些研究表明,Notch信号通路涉及到一些癌症的恶性表型,例如乳腺癌和T细胞白血病等恶性肿瘤。肺癌中,Notch信号通路的作用研究是在转基因小鼠模型中进行的,研究发现,激活的Notch信号通路在肺泡上皮中表达增多,能够协同Myc通路,对非小细胞肺癌的发生和发展起到促进作用。另一个研究中指出,Notch1能够通过调节p53的稳定性,从而抑制p53调控的细胞凋亡,影响肺腺癌的生长。Notch信号通路通过配体-受体结合作用激活通路。其中涉及到五种配体,DLL1,DLL3,DLL4,Jagged-1和Jagged-2,以及四种受体,Notch1,Notch2,Notch3和Notch4。与配体的结合诱导一系列Notch构象上的变化,导致S2位点的暴露,在金属蛋白酶、肿瘤坏死因子-α转换酶作用下,裂解为2个片段,氮端裂解产物为胞外区,被配体表达细胞吞噬,碳端的裂解产物在跨膜区的第三个裂解点S3,经过主要为γ-secretase的成分裂解,释放出Notch蛋白的活性形式,即NICD。NICD进入细胞核,发挥功能。NICD的靶基因主要有cyclin D1,c-Myc,p21,p27,nuclear factor-kappa B(NF-κB),survivin,slug和Nanog,这些靶基因都具有促进癌症发生和发展的作用。KIAA0247是一个编码303个氨基酸的I型跨膜蛋白,在各个物种间高度保守。尽管,在癌症中,没有发现KIAA0247的突变,KIAA0247由于启动子区域发现了p53的结合位点而受到关注,被认为是一个潜在的抑癌基因。KIAA0247曾经被一个研究者命名为DRAGO(drug-activated gene overexpressed),意思为药物诱导下的基因过表达,因为在多种抗肿瘤药物,例如顺铂、烷化剂、抗代谢药物、拓扑异构酶II抑制剂、紫杉烷类,以及Nutlin-3的作用下,HCT116 p53+/+和HCT116 p53+/-细胞出现KIAA0247表达量2到4倍的增多,而在HCT116 p53-/-细胞中,则不出现KIAA0247增多的现象。KIAA0247的过表达也同样出现在5氟尿嘧啶治疗后,在结肠癌患者中,粪便中KIAA0247的m RNA表达量高的一组,较表达量低的一组有着更好的预后。在卵巢癌中,进展期肿瘤KIAA0247的m RNA表达量较初期肿瘤中的m RNA表达量有大约百分之三十的降低。另一个研究表明在神经胶质瘤中,KIAA0247的m RNA表达量较正常脑组织少,并且KIAA0247的过表达,通过抑制AKT和Stat3信号通路,从而抑制胶质细胞瘤细胞系的增殖和恶性表型,促进细胞凋亡。KIAA0247基因位于人类染色体14q24.1,这一部分染色体包含了SERPINA1基因,这一基因与α-抗胰蛋白酶缺乏有关,能够导致肺组织损伤,肺气肿和肺癌的发生。然而,KIAA0247在肺癌中的生物学行为方面的作用尚不清楚,并且关于KIAA0247与肺癌临床病理的相关性也尚无报道。在我们的研究中,旨在探究KIAA0247的m RNA和蛋白表达与临床病理的相关性,以及研究KIAA0247的表达水平与肺癌细胞系的细胞生物学行为关系,及其潜在的详细分子生物学机制与其参与调控的过程。研究方法:1.免疫组织化学染色实验选取了2013年到2015年,在中国医科大学附属第一医院进行手术的非小细胞肺癌病例197例进行临床病理相关性分析。所有参与到本次病理相关性分析的197例患者,均未接受过手术前的化疗和放疗。男性患者(N=127例),女性患者(N=70例),年龄在30至90岁之间。根据国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)第八版肺癌TNM分期系统,根据病理信息,Ⅰ期患者(N=83例),Ⅱ期和Ⅲ期患者共(N=114例)。根据WHO分类系统,组织学诊断和组织分化程度方面,鳞状细胞癌(N=101例),腺癌(N=96例),中分化至高分化(N=126例),低分化(N=71例)。肿瘤大小分类,小于等于三厘米病例(N=108例),大于三厘米病例(N=89例)。淋巴结转移病例(N=84例),淋巴结未转移病例(N=113例)。通过免疫组织化学染色实验,进行染色检测,所有切片的染色强度和染色细胞所占百分比,进行半定量计分评价,结果进行双盲的临床数据分析,其中,根据染色强度,KIAA0247表达水平评定分数设为:0分(不表达),1分(弱表达,淡黄色颗粒),2分(中等强度表达,黄色颗粒),3分(强表达,棕色颗粒);染色细胞所占百分比评定分数为:0分(0%),1分(1%-30%),2分(31%-70%),3分(71%-100%)。在单例样本病理切片中,染色强度的得分与染色细胞所占百分比得分进行乘积,最终得分在0到9分之间,用最终乘积分数进行统计分析。肿瘤样本病理切片得分大于三分的,被认定为KIAA0247阳性表达,小于或者等于三分的病例被认定为是KIAA0247低表达。使用SPSS 16.0软件进行分析,使用单样本配对t检验方法,分析KIAA0247表达水平与临床病理相关因素间的统计学关系。以P值小于0.05为标准,界定是否具有统计学意义。2.我们随机选取35例手术术中取出的新鲜非小细胞肺癌标本,包括肿瘤组织和相邻的正常肺组织,进行real-time PCR检测KIAA0247的m RNA表达水平,利用SPSS16.0软件,选取单样本配对t检验方法,分析KIAA0247的m RNA水平是否具有临床病理相关性。利用Kaplan-Meier数据库,分析KIAA0247与肺癌患者预后的相关性。实验组从中科院上海细胞库购买常用的非小细胞肺癌细胞系,按照细胞库官方网站公开的培养配方,使用Gibco 1640培养基,添加10%胎牛血清,无水葡萄糖,碳酸氢钠,丙酮酸钠,培养A549,H292,H1299,H460,H661细胞系,使用Gibco MEM培养基,添加10%胎牛血清,无水葡萄糖,碳酸氢钠,丙酮酸钠,培养SK-MES-1细胞系,使用DMEM高糖培养基培养人类正常支气管上皮细胞系HBE细胞。所有细胞,均在无菌、有滤孔的培养瓶中进行培养,在无菌六孔板中进行处理。3.将细胞爬片放入细胞培养24孔板中,将不同种细胞系的细胞,铺于孔板中,待贴壁在细胞爬片之后,PBS洗净,4%多聚甲醛固定10—15分钟,用0.1%Triton X-100透膜打孔10-15分钟,用非免疫胎牛血清白蛋白封闭两个小时,目标KIAA0247抗体在4℃敷育过夜,荧光二抗避光敷育两个小时,最后避光条件下DAPI染细胞核。在荧光显微镜下,激发目标光,观察KIAA0247在各种细胞系中的定位及相对表达情况。4.利用Lipofectamine 3000,向细胞内转KIAA0247 si-RNA和KIAA0247质粒,达到下调和上调KIAA0247目标蛋白表达的目的,为后续细胞功能学实验提供基础。在无菌细胞六孔培养板中同步细胞周期,下调或是上调KIAA0247的蛋白表达水平,收集没有互相贴紧的细胞,固定、染色,使用流式细胞仪检测细胞周期的变化,分析KIAA0247对细胞周期方面的影响。5.在无菌细胞六孔培养板中培养细胞,下调或是上调KIAA0247的蛋白表达水平,进行细胞计数,每组间以同样数量,同等重复复孔,接种到96孔培养板,一共五板,连续五天,每天定时加MTT,检测细胞连续增殖能力。6.在无菌细胞六孔培养板中培养细胞,下调或是上调KIAA0247蛋白表达水平,进行细胞计数,每组间以相同数量,重复三次复孔,接种到新的无菌六孔培养板中,连续培养10-15天,待细胞集落形成,收取培养板,固定、染色,计数集落形成数量和大小,分析细胞集落形成能力中KIAA0247的作用。7.在无菌细胞六孔培养板中接种细胞,下调或是上调KIAA0247目标蛋白表达,进行细胞计数,按组间相同数量铺于transwell小室上室,同等时间取出transwell小室,固定、染色、去除上室细胞,计数下室细胞。上室铺基质胶时,用以检测KIAA0247对细胞侵袭能力的影响,不铺基质胶时,用以检测KIAA0247对细胞迁移能力的影响。8.经过下调或是上调KIAA0247蛋白表达的细胞,收集细胞,使用NP40蛋白裂解液进行裂解,并收集细胞总蛋白,通过蛋白免疫印迹实验对细胞增殖、迁移、侵袭相关的蛋白进行检测和分析,寻找可能的作用通路。9.利用蛋白免疫印迹实验结果分析出KIAA0247可能通过Notch信号通路发挥肺癌细胞系生物学行为功能的影响,使用Notch信号通路抑制剂DAPT,特异性抑制Notch信号通路,验证KIAA0247抑制非小细胞肺癌生物学行为是通过Notch信号通路发挥作用。结果:1.KIAA0247定位于细胞浆和细胞核。在临床肺癌病例中,肺癌组织中KIAA0247的m RNA表达水平显著低于癌旁正常肺组织,临床病理相关性分析中,KIAA0247蛋白表达水平与分化程度、淋巴结转移、P-TNM分期有相关性,但是与患者年龄、患者性别、肿瘤分型以及肿瘤大小没有相关性。Kaplan-Meier分析KIAA0247与肺腺癌患者预后有相关性。2.在非小细胞肺癌细胞系中,KIAA0247能够抑制非小细胞肺癌细胞系增殖能力,抑制细胞周期G1向S期转变。3.在非小细胞肺癌细胞系中,KIAA0247能够抑制非小细胞肺癌细胞系的迁移和侵袭能力。4.蛋白免疫印迹检测发现KIAA0247能够调控增殖,迁移,侵袭相关功能蛋白,并且负向调控EMT相关蛋白,经过分析,能够抑制Notch信号通路的激活。5.Notch信号通路抑制剂DAPT作用后,结合功能学实验,以及蛋白免疫印迹实验分析,确定KIAA0247通过Notch信号通路发挥对非小细胞肺癌细胞系生物学行为抑制方面的作用。结论:1.KIAA0247在非小细胞肺癌中低表达,并且KIAA0247表达与癌细胞的分化程度和非小细胞肺癌患者的存活率呈正相关,与淋巴结转移,肺癌分期呈负相关2.KIAA0247通过p21-Cyclin D1-CDK4轴的调控造成G1/S期的阻滞,从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖能力3.KIAA0247通过下调Rho A,Rho C,MMP9,上调Rho B,抑制非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭能力3.KIAA0247负向调控Notch信号通路从而抑制非小细胞肺癌的增殖,迁移和侵袭能力
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

细胞核,细胞浆,表达水平,临床病理学

图 3.2.1 免疫荧光检测 KIAA0247 在非小细胞肺癌细胞系中的表达情况（200 X）图中红色荧光显示 TRITC 标记的 KIAA0247 蛋白，蓝色荧光显示 DAPI 标记的细胞核，Merge 为合并图层后，显示出 KIAA0247 的定位在细胞核和细胞浆均有关于 KIAA0247 是否具有临床病理学相关性，我们选取了 197 例接受临床外科手术治疗患者的病理标本，进行免疫组织化学染色检测 KIAA0247 的定位和相对表达情况。在肺腺癌和肺鳞癌中，KIAA0247 定位于细胞核和细胞浆，我们对所有表达的 KIAA0247 进行统计评分。在正常肺支气管和肺泡中，KIAA0247 的表达量较肺癌组织中 KIAA0247 表达水平高，随着分化程度提高，KIAA0247 表达水平呈增多趋势（图 3.2.2）。

高分化鳞癌,非小细胞肺癌,低分化鳞癌,高分化腺癌

13图 3.2.2 KIAA0247 在非小细胞肺癌中的表达情况（200 X）图中Ⅰ为 KIAA0247 在正常肺泡组织中强阳性表达，Ⅱ为 KIAA0247 在肺正常支气管中的强阳性表达，Ⅲ和Ⅳ分别为 KIAA0247 在高分化鳞癌和高分化腺癌组织中的表达情况，Ⅴ和Ⅵ分别为 KIAA0247 在低分化鳞癌和低分化腺癌组织中的表达组织中低表达的情况经过染色强度和染色范围评分的乘积得分，对 197 例非小细胞肺癌病理免疫组化结果进行统计学分析，KIAA0247 的表达水平与临床病理因素中年龄（P=0.865），性别（P=0.119），组织学分型（P=0.311）和肿瘤大小（P=0.134）无统计学意义，

相关性,表达水平,统计学,淋巴结转移

14图 3.2.3 KIAA0247 免疫组化表达水平与临床病理因素相关性图中 KIAA0247 表达与分化程度（P＜0.001），淋巴结转移（P＜0.001），TNM 分期（P＜0.001）存在相关关系，而与年龄（P=0.865），性别（P=0.119），组织学分型（P=0.311）和肿瘤大小（P=0.134）没有统计学相关性此外，选取 35 对临床新鲜离体的肺癌组织和配对的癌旁正常肺组织新鲜标本，提取组织 RNA，利用实时定量 real-time PCR 技术，检测组织标本中 KIAA0247 mRNA表达水平。结果显示，在肺癌肿瘤组织中，KIAA0247 mRNA 表达水平明显低于配对的正常肺组织，经过 SPSS 单样本配对 t 检验分析，KIAA0247 在癌组织和癌旁正常肺组织的表达具有统计学差异（P＜0.05）（图 2.3.4）。

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