TP53INP1抑制缺氧诱导的乳腺癌上皮间充质转化及血管生成拟态形成的机制研究

发布时间：2020-07-24 02:53

【摘要】：研究目的:乳腺癌(breast cancer)是女性中较为常见的恶性肿瘤之一,其转移已成为乳腺癌患者死亡的主要原因,同时当乳腺癌细胞处于缺氧状态时能增加转移能力。肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry)是由肿瘤细胞围成的一种血液供应模式,它的存在影响着病人的不良预后且与肿瘤转移呈正性相关关系。肿瘤蛋白P53诱导核蛋白1(TP53INP1)是一种压力诱导蛋白,作为一种抑癌蛋白,在多种肿瘤中起到抑制其发生发展的作用,研究发现TP53INP1能抑制多种肿瘤的转移,但是TP53INP1在乳腺癌血管生成拟态中研究机制尚未明确。本研究探讨TP53INP1在乳腺癌血管生成拟态(VM)及上皮间充质转化(EMT)形成中的作用,并进一步阐明了其在缺氧微环境中参与的分子机制及信号转导通路,为乳腺癌的抗血管药物治疗及抑制转移提供新的思路继而提高患者的生存率。研究方法:1.收集100例由有资历的病理医师确诊后的乳腺癌组织标本,其标本由天津医科大学总医院经手术切除所获得,通过免疫组织化学和CD31/PAS双重染色方法观察TP53INP1的表达情况和VM存在的情况,并进行临床病理资料分析,TP53INP1与VM在乳腺癌中两者的相关性。采用Kaplan-Meier法对TP53INP1和VM进行生存分析。2.利用免疫组织化学方法检测100例乳腺癌组织中HIF-1α、VE-cadherin、Snail的表达情况,通过卡方检验分析TP53INP1与HIF-1α、VE-cadherin、Snail的差异,Pearson统计方法分析TP53INP1与HIF-1α、VE-cadherin之间的相关性。3.从四种乳腺癌细胞系中(HS-578T、MDA-MB-231、MCF-7、T-47D)通过Western blot检测TP53INP1本底表达情况筛选两种细胞系。通过慢病毒转染质粒TP53INP1进入目标细胞,筛出稳定转染的上下调TP53INP1乳腺癌细胞系。4.通过划痕,迁移侵袭,三维培养功能实验观察TP53INP1对乳腺癌细胞迁移侵袭,成管能力的影响。通过Western blot实验,免疫荧光实验证实上下调TP53INP1后EMT相关蛋白指标(E-cadherin、Vimentin、Snail、GSK-3β、p-GSK-3β),VM相关蛋白指标(VE-cadherin、MMP2、HIF-1α)的表达的情况。5.在转染的细胞系中加入缺氧诱导剂Co Cl2建立缺氧模型,重复上述功能实验以及Western blot实验证明在缺氧环境下TP53INP1对乳腺癌迁移侵袭能力,EMT形成及VM形成的影响。6.通过流式细胞术检测加入活性氧抑制剂NAC乳腺癌MDA-MB-231细胞系的ROS水平以及上下调后及缺氧环境下转染的上下调TP53INP1乳腺癌细胞系中活性氧(ROS)的水平,并且加入ROS抑制剂NAC后通过Western blot检测EMT和VM相关蛋白表达的情况。以及通过三维培养及Western blot观察加入抑制剂NAC后的成管情况,以及VE-cadherin和HIF-1α蛋白表达情况。7.通过Western blot实验对共转染过表达TP53INP1和下调HIF-1αMDA-MB-231细胞系和共转染低表达TP53INP1和下调HIF-1αMCF-7细胞系VM相关指标的检测,初步证实TP53INP1和HIF-1α之间的相互作用。8.选取天津医科大学培育的自发性乳腺癌津白2小鼠模型,通过Western blot从五种不同的自发性乳腺癌中筛选出与MDA-MB-231与MCF-7两种细胞系TP53INP1表达一致的两种自发瘤。在瘤内注入上调或下调TP53INP1质粒观察肿瘤的生长情况,通过免疫组化和endomucin/PAS双染技术检测该肿瘤TP53INP1表达情况,存在VM情况和EMT和VM相关指标(E-cadherin、Snail、HIF-1α、MMP2、VE-cadherin)表达情况。研究结果:1.在人乳腺癌组织标本中,64例(64/100)TP53INP1蛋白呈低表达或不表达。TP53INP1高表达在胞浆和核中可见,与TNM分期(P=0.005),淋巴转移(P=0.015),是否是三阴(P=0.012)和VM(P=0.009)呈负相关关系。其中73例中的癌组织TP53INP1的表达较对应的癌旁组织降低,且具有统计学意义(P=0.045)。TP53INP1与VM呈负性相关(P=0.009),Kaplan-Meier分析表明100例患者VM和低表达TP53INP1与不良预后有关。2.卡方检验显示TP53INP1与HIF-1α(P=0.012),VE-cadherin(P=0.044),Snail(P=0.001)的表达呈负性相关关系,且具有统计学意义。Pearson分析显示TP53INP1与HIF-1α(r=-0.0293,P=0.003)、VE-cadherin(r=-0.0227,P=0.023)具有负性相关关系。3.通过Western blot检测两种三阴乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和HS-578T),两种非三阴乳腺癌细胞系(MCF-7和T-47D)TP53INP1的表达情况,筛选出TP53INP1表达能力最强的(MCF-7)和表达能力最弱的(MDA-MB-231)两种细胞系。将MDA-MB-231细胞转染上调TP53INP1质粒,MCF-7细胞系稳定转染下调TP53INP1质粒。4.建立稳转的上下调质粒的乳腺癌细胞系后,实验结果显示上调TP53INP1的MDA-MB-231细胞系侵袭能力,伤口愈合能力以及成管能力较对照组明显减弱(P0.005),同理,下调TP53INP1后的MCF-7细胞侵袭能力,伤口愈合能力以及成管能力较对照组明显增强(P0.005)。通过Western blot上调TP53INP1MDA-MB-231细胞系中E-cadherin、GSK-3β的蛋白表达较对照组表达上升,Vimentin、Snail、p-GSK-3β、VE-cadherin、MMP2、HIF-1α蛋白表达较对照组表达下降(P0.005)。下调TP53INP1的MCF-7细胞系出现相反的结果(P0.005)。5.Co Cl2处理后,过表达TP53INP1组较对照组迁移侵袭能力以及成管能力较对照组有所降低,Western blot显示:E-cadherin、GSK-3β的蛋白表达增加,Vimentin、Snail、GSK-3β磷酸化,VE-cadherin、MMP2、HIF-1α蛋白表达较对照组表达降低(P0.005)。下调TP53INP1后的MCF-7细胞系迁移侵袭能力,成管能力较对照组有所升高,Western blot显示:E-cadherin、GSK-3β的蛋白表达降低,Vimentin、Snail、GSK-3β磷酸化,VE-cadherin、MMP2、HIF-1α蛋白表达较对照组表达升高(P0.005)。6.流式结果显示:Co Cl2处理后,MDA-MB-231细胞产生的ROS较对照组增加,加入活性氧抑制剂NAC后ROS降低,上调TP53INP1处理后ROS较对照组降低,加入NAC后变化并不明显;在MCF-7细胞系中,经下调处理的TP53INP1细胞中产生的ROS增加,但是加入NAC后ROS同样也减低。加入活性氧抑制剂NAC不同浓度处理后,乳腺癌细胞ROS产生的含量、成管能力,以及VE-cadherin和HIF-1α的表达随之降低,其中浓度为20m M时为最低。7.无论是否加入Co Cl2化学诱导剂在MDA-MB-231细胞系中共转染上调TP53INP1和下调HIF-1α质粒VE-cadherin和MMP2的表达较对照组降低,敲除TP53INP1的MCF-7细胞中转染下调HIF-1α质粒,VE-cadherin和MMP2的蛋白表达较对照组表达增加。8.在TA2小鼠模型中,注入TP53INP1过表达质粒的高转移组瘤子生长速度较高转移组对照组明显降低(P0.005),sh TP53INP1-低转移组瘤子较对照组生长增强;TP53INP1-高转移组形成VM的管道明显减少,sh TP53INP1-低转移组可见增多;通过免疫组织化学方法检测到TP53INP1-高转移组中EMT和VM相关指标:E-cadherin表达增加,HIF-1α,Snail,VE-cadherin,MMP2表达相对降低,与体外实验结果一致,sh TP53INP1-低转移组EMT和VM相关指标:E-cadherin表达降低,HIF-1α、Snail、VE-cadherin和MMP2的表达较对照组升高。研究结论:1.在人乳癌组织标本中,TP53INP1与乳腺癌分期,淋巴结转移以及VM的存在呈负相关关系,而且与病人的不良预后有关。2.通过体外和体内实验,TP53INP1不仅抑制乳腺癌细胞迁移侵袭及成管能力,而且抑制EMT和VM相关蛋白的表达及形成。3.在缺氧环境中,TP53INP1抑制了缺氧诱导的乳腺癌迁移侵袭,成管能力以及EMT和VM的形成。并初步证实TP53INP1可抑制HIF-1α介导的VM的形成。4.在乳腺癌细胞中,ROS促进乳腺癌细胞VM的形成。5.初步探讨了在乳腺癌中,TP53INP1抑制缺氧诱导的EMT和VM的形成通过ROS介导的GSK-3β/Snail信号通路的参与。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

图 1.1 100 例乳腺癌组织标本 TP53INP1 的表达情况（A）在乳腺癌组织中TP53INP1 阳性表达，主要定位在胞浆或胞核（B）相应的癌旁组织中 TP53INP1的阳性表达（C）TP53INP1 的阴性表达。表 1.1 TP53INP1 在乳腺癌组织及对应的癌旁组织中表达相关分析*差异具有统计学意义1.2.2 人乳腺癌组织中 TP53INP1 表达情况及于临床病理参数，临床预后之间的关系cancer tissueN=73pericarcinous tissueN=73χ2 PTP53INP1Negative 37 254.037 0.045*Positive 36 48

1.2 TP53INP1（+）与 TP53INP1（-）生存分析曲织中 TP53INP1 表达与 Snail 和 HIF-1α表达的关系 Snail 作为 EMT 的转录因子，而 HIF-1α是形成 E子，分析 TP53INP1 与 Snail，HIF-1α之间的关系 对上皮间充质转化和血管生成拟态影响提供更有 1.3 所示定位于胞浆和胞核中 Snail，定位于胞核-1α阳性表达患者占 TP53INP1 阴性表达组中 72%性相关关系（26/36 P=0.044），同样的 TP53INP1.001）。我们还通过 Pearson 相关分析结果发现TP5（r=-0.0293，P=0.003）。 TP53INP1 在乳腺癌中与 HIF-1α和 Snail 蛋白的相TP53INP1χ2 P-（%） +（%）

腺癌组织中 Snail 与 HIF-1α的免疫组织化学染色。在 TP和 HIF-1α呈阳性表达，TP53INP1 阳性组中 Snail 和 HIFnail 阳性表达位于胞浆和胞核中，HIF-1α阳性表达在胞乳腺癌组织中 TP53INP1 与 HIF-1α相关分析（r=-0.029组织中 TP53INP1 与 VM 的关系

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Binhua P.Zhou;;Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer progression and metastasis[J];癌症;2011年09期

本文编号：2768211