MicroRNA-195-5p调控bFGF抑制胃癌发生发展的机制研究

发布时间：2020-07-25 15:27

【摘要】：背景与目的胃癌是一种发病率较高且预后较差的恶性肿瘤之一,是全球发病率第五位的恶性肿瘤,致死率仅次于肺癌、肝癌,居第三位,严重威胁着人类的生命健康。虽然在胃癌的诊断及治疗方面,业已取得较大的进步,但针对早期胃癌的诊断及进展期胃癌的诊疗尚显局限。目前国际上尚没有一致公认的进展期胃癌标准化疗方案。调整现有的用药策略以及寻找更为有效的联合治疗方案是治疗进展期胃癌的一个重要的研究方向。MicroRNA(miRNAs)是内源性的长度约21-25nt的一类非编码RNA,具有调节基因表达活性的功能,广泛存在于真核生物体中,并在进化序列中保守,参与了机体的生物学进程,包括细胞的增殖、分化、凋亡及信号转导等过程。近年研究发现,MicroRNA-195-5p(miR-195-5p)属microRNAs其中的一类别,研究证实,miR-195-5p在乳腺癌,骨肉瘤及结直肠癌等肿瘤细胞系中表达异常,并在肿瘤细胞的凋亡调节及肿瘤的形成过程中起到一定的作用。但因miRNA分子靶向调控蛋白编码基因的多样性,miR-195-5p如何在胃癌组织中发挥作用从而改变肿瘤细胞功能表型的机制研究尚需进一步明确。碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种相对分子质量为(1.6-1.8)×10~4,能促进来源于中胚层及神经外胚层细胞增殖的多肽生长因子,能刺激成纤维细胞的分裂增殖,并且它的等电点呈碱性(pH 9.6),因而被命名为碱性FGF。除此以外,其还具有广泛的生物学活性,比如,其能促进血管生成;改善创伤愈合;加速神经营养与修复并且促进胚胎发育与分化特性等,与肿瘤的发生发展关系密切。有研究表明bFGF在胃癌的发生发展中发挥着重要作用,但目前针对bFGF对胃癌的影响及机制发生的基础研究相对较少。本研究拟评估胃癌患者肿瘤组织中miR-195-5p与bFGF mRNA的表达关系,并进一步分析miR-195-5p是否通过直接靶向bFGF来调节肿瘤的发生发展。方法通过Target Scan Human,ComiR等数据库查询miR-195-5p的潜在靶标。采用MicroRNA分析方法、实时定量荧光PCR和Western blot等检测方法评估miR-195-5p和bFGF mRNA及蛋白的表达水平。使用miR-195-5p mimics和对照mimics转染胃癌细胞系SNU-1和KATO-3。用划痕试验及transwell侵袭实验来检测miR-195-5p mimics和对照组转染的胃癌细胞系的迁移及侵袭能力。运用双荧光素酶报告实验验证miR-195-5p与靶基因bFGF的直接联系。构建含bFGF基因的慢病毒并感染稳表达miR-195-5p的胃癌细胞,再次评估细胞的迁移及侵袭能力。构建SCID小鼠的胃癌异体移植瘤模型,注射后二十天处死裸鼠,切下瘤体后称重并测量,随后固定瘤体组织备进一步分析使用。结果(1)人胃癌组织中miR-195-5p和bFGF mRNA的表达水平呈负相关性(r=-0.735,p0.001);(2)稳表达miR-195-5p的细胞系SNU-1和KATO-3中,胃癌细胞bFGF mRNA和蛋白表达水平均降低;(3)SNU-1和KATO-3的划痕实验和侵袭实验结果显示:划痕后24 h稳表达miR-195-5p的SNU-1和KATO-3细胞系迁移距离小于对照组细胞;与对照组相比,稳表达miR-195-5p的SNU-1和KATO-3细胞系显著降低侵入细胞数目,结果提示miR-195-5p抑制胃癌细胞的迁移和侵袭;(4)荧光素酶活性测定实验结果显示:稳定过表达胃癌细胞系中miR-195-5p表达水平升高;在胃癌细胞系中稳定表达上述两种荧光素酶载体时,miR-195-5p过表达降低了野生型bFGF 3’-UTR-wt的荧光素酶活性,而突变型bFGF3’-UTR-mut的荧光素酶活性没有改变,验证了miR-195-5p直接识别和靶向bFGF3’-UTR,从而抑制bFGF表达;(5)建立稳表达miR-195-5p的胃癌小鼠移植模型,根据肿瘤重量及大小数据检测,与对照组相比,miR-195-5p组肿瘤的重量与体积明显被抑制;(6)结合动物实验结果,稳表达miR-195-5p的SNU-1和KATO-3两种肿瘤模型中,肿瘤组织中bFGF mRNA和蛋白质表达水平均受到抑制,与我们先前的体外实验数据一致。这表明miR-195-5p在体内体外均能下调bFGF的表达。同时在SNU-1和KATO-3细胞株中过表达miR-195-5p和bFGF后,bFGF mRNA和蛋白表达水平在两种胃癌细胞系中恢复到对照水平。(7)SNU-1和KATO-3细胞过表达miR-195-5p后其细胞迁移和侵袭能力下降,在这两种细胞中重新引入bFGF因素后这种抑制作用能够被逆转。当这些细胞被注射到SCID小鼠体内建立异种移植模型时,bFGF的表达明显逆转了miR-195-5p对胃癌肿瘤的抑制作用。结论miR-195-5p通过直接靶向作用bFGF来调节肿瘤的发展进程,通过调节降低bFGF的表达进而抑制胃癌的发生。这为我们研究胃癌的发病机制提供了新的思路,为改进进展期胃癌的治疗方案(靶向治疗)提供了新的理论依据。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

3 结果3.1 人胃癌组织中 miR-195-5p 与 bFGF mRNA 表达的负相关性通过 Target Scan Human，ComiR 等数据库查询分析[24]，我们发现了 miR-19序列自 5’端起存在与 bFGF mRNA 3’-UTR 区上的互补配对的识别序列 (图 1提示在肿瘤的发生发展中，bFGF 很可能是 miR-195-5p 的一个潜在作用的下标，miR-195-5p 有可能直接针对 bFGF mRNA 并介导其降解。我们分析比较了例胃癌患者组织标本中 miR-195-5p 与 bFGF mRNA 表达水平的相关性。如图所示，miR-195-5p 与 bFGF mRNA 呈负相关(r=-0.735，P < 0.001)。

between miR-195-5p and bFGF mRNA in tumor samples from 18 GC patienValues were in arbitrary units (au). (B) Possible miR-195-5p complementasequence on the 3’-UTR of bFGF mRNA3.2 miR-195-5p 过表达可明显下调SNU-1及 KATO-3 细胞中bFGF mRNA及蛋表达水平通过 miR-195-5p mimics 转染 SNU-1 和 KATO-3 细胞，并以 control mim染这两株细胞作为对照，运用实时定量 PCR 及 Western blot 检测方法，miR-195-5p 转染前后细胞中 bFGF mRNA 及 bFGF 蛋白表达水平差异，miR-195-5p 过表达可明显下调这两株细胞系中 bFGF mRNA 表达水平及 bFGF表达水平。（图 2A 和 2B）

spectively with actin as the loading the control. Values were mean ± SD froast three independent experiments. ** P<0.01, * P<0.05, compared to the contro.3 miR-195-5p 过表达抑制胃癌细胞的迁移和侵袭本实验组分别通过划痕实验和 transwell 侵袭实验来研究 SNU-1 和 KAT系的迁移和侵袭能力。图3A和3B显示两个细胞系划痕后24小时创伤愈合表达 miR-195-5p 的细胞迁移距离小于对照组的细胞。图 3C 和 3D 细胞侵袭果显示，与对照组相比，SNU-1 和 KATO-3 细胞系中 miR-195-5p 的过表达低了侵袭细胞数。结果表明 miR-195-5p 过表达抑制了胃癌细胞的迁移和侵。

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本文编号：2770006