接枝式还原响应型肝癌诊疗纳米探针的实验研究

发布时间：2020-07-25 18:22

【摘要】：目的:探讨具有两亲性、智能性、靶向性的接枝式HA-SS-PZLL@SPIO/DOX肝癌诊疗一体化纳米探针的理化性质、生物安全性、抗肿瘤作用及磁共振增强显影效果。研究方法:1、通过化学方法合成具有二硫键的接枝聚合物胶束HA-SS-PZLL,在水性介质中与超顺磁性氧化铁(SPIO)及阿霉素(DOX)自组装形成HA-SS-PZLL@SPIO/DOX肝癌诊疗一体化纳米探针;采用核磁共振氢谱(~1HNMR)、傅立叶红外光谱(FTIR)分析特征性质子峰及吸收峰,证实纳米胶束的成功合成;采用动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)检测胶束的粒径及形貌;采用芘荧光法检测临界胶束浓度(CMC);通过DOX及SPIO含量测定评价胶束的阿霉素包封率及SPIO载药量、药物释放(还原敏感性测定);通过磁共振扫描计算纳米探针的T_2弛豫率,评价其增强显影能力。实验另制备了不含二硫键的HA-PZLL@SPIO/DOX作为对照研究。2、在细胞水平:通过对照实验,用四唑盐比色法(MTT)计算细胞存活率评价HA-SS-PZLL胶束的生物安全性,及HA-SS-PZLL@SPIO/DOX纳米探针对人肝癌细胞的杀伤力;采用DOX荧光观察、DAPI染核以及流式细胞术定性、定量分析人肝癌细胞对纳米探针的摄取情况、胞内分布,以及纳米探针的抗肿瘤细胞能力;通过细胞悬液MRI检查,测量平均T_2值评价纳米探针体外MR增强显影效果。3、在动物体内水平:建立BALB/c裸鼠肝癌原位模型及皮下荷瘤模型并分组给药对照,通过HE染色明确肿瘤组织及对主要器官进行药物安全性评价,通过普鲁士蓝染色观察蓝染细胞分布情况,定性检测各主要脏器及肿瘤的铁分布;通过测量皮下荷瘤模型肿瘤的体积及重量,绘制肿瘤生长曲线及计算肿瘤抑制率,进行统计学分析,评价纳米探针的抗肿瘤疗效;通过皮下荷瘤模型磁共振检查,测量平均CNR值及T_2值并进行分析比较,评价纳米探针的体内MR增强显影效果。研究结果:1、通过~1HNMR和FTIR证实了HA-SS-PZLL接枝聚合物胶束的特征性质子峰及吸收峰;DLS测得HA-SS-PZLL胶束平均粒径128.5±5.7 nm,TEM测得HA-SS-PZLL胶束及HA-SS-PZLL@SPIO/DOX纳米探针呈球形,平均粒径分别为91.5±3.5 nm、105.5±4.8 nm;芘荧光法测得HA-SS-PZLL具有较低CMC值0.0092 mg/mL;通过DOX含量测定得知胶束DOX包封率及SPIO载药量达50%以上,在含谷胱甘肽(GSH)的还原条件下纳米探针具有更高效的药物释放;MR检查发现该纳米探针具有较高的T_2驰豫率(231.0 Fe mM~(-1)·s~(-1))。2、MTT法测得HA-SS-PZLL接枝聚合物胶束生物安全性高,细胞生存率80%以上(孵育48 h),在较高药物浓度(10 ug/mL)条件下,HA-SS-PZLL@SPIO/DOX组及HA-PZLL@SPIO/DOX组,肿瘤细胞杀伤作用与Free DOX组接近(孵育48 h);荧光观察、DAPI染核以及流式细胞分析结果显示:Free DOX组荧光强于载药胶束组,Free DOX主要进入细胞核内,而HA-SS-PZLL@SPIO/DOX及HA-PZLL@SPIO/DOX主要位于细胞质内;体外MRI结果显示HA-SS-PZLL@SPIO/DOX组平均T_2值明显低于空白对照组及SPIO组。3、HA-SS-PZLL@SPIO/DOX组实验鼠平均体重比对照组增长良好,且HE染色显示主要脏器未见明显损害,具有良好生物安全性;普鲁士蓝染色显示HA-SS-PZLL@SPIO/DOX组肿瘤组织有更多的铁聚集(代表药物分布);治疗周期内,HA-SS-PZLL@SPIO/DOX组皮下荷瘤模型肿瘤的体积及重量均比对照组显著缩小,有统计学差异;通过皮下荷瘤模型的磁共振检查,HA-SS-PZLL@SPIO/DOX组比对照组肿瘤平均T_2值及T_2WI信号下降更明显,差异有统计学意义。结论:本实验制备的HA-SS-PZLL@SPIO/DOX纳米探针具有良好的理化性质,在体内外具有良好的生物安全性、智能性及靶向性,抗肿瘤效果及MR增强显像效果较好,有利于肝癌诊疗一体化的应用。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

牛眼,美国学者,玻璃体,结构式

的生物相容性较高[34]，可以很容易的被代谢分解而然可降解高分子材料：前一类主要如聚磷酸酯，聚氨要如一些纤维蛋白和胶原等[35，36]。其中聚氨基酸的霉素，紫杉醇相关药物[37，38]；对比也可以看出这种的结构、磁性等也较容易控制，此外其稳定性高，不可以较好的满足药物载体材料的多方面要求。料的选择luronic Acid，HA)是一种酸性粘多糖，是细胞外基质结构和功能方面其作用很重要，是由 D-葡萄糖醛酸线性高分子，见图 1-1。

生物相容性,赖氨酸,聚赖氨酸,结构式

势种物质的生物相容性很高，也可以方便的合成，其，因而在生物医学应用领域中表现出巨大的发展潜的一级结构较为单一，其对应的 NCA 开环聚合产于实验研究的前提。性：聚氨基酸可在体内酶类作用下发生降解，这在，这种降解的方式和途径存在一定的差异，因而在这些影响因素进行控制而实现。性：由于聚氨基酸结构组成和天然蛋白质及多肽相一氨基酸聚合形成的产物均不具有免疫原性，有良基-L-赖氨酸(PZLL)一类简单的合成型多聚物，其基本的单元为赖氨酸成中。

路线图,路线图,苄氧羰基,赖氨酸

图 2-2 a-alkyne-SS-PZLL 的合成路线图在氩气环境下，先将 100.0 mL 四氢呋喃加入到三口圆底烧瓶中，接着向其中加入 5.0ε-苄氧羰基-L-赖氨酸 (17.8mmol)及 3.0 g 三聚光气 (10.1mmol)，在 50 摄氏度条件下反应 h，然后减压蒸馏将四氢呋喃蒸发去除掉，将所得油状物通过乙酸乙酯溶解之后，利用冷碳酸氢钠洗涤处理而将其中的有机相提取出之后，接着进行干燥、过滤处理之后就可得中间目标产物 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐。将 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐及无水 DMF 加入到圆底烧瓶中，接着再加入PA -Cyst，通入氩气，25 摄氏度条件下反应 3 h，通过甲醇沉淀、过滤处理之后接着干燥得到(α-alkyne-SS-PZLL)白色粉末产物。.1.3 HA-SS-PZLL的合成

【参考文献】