CENPK在肝癌增殖、侵袭和迁移中的作用及相关机制研究

发布时间：2020-07-26 14:29

【摘要】：【背景】肝细胞肝癌是世界上第六大常见的肿瘤,其致死率高居所有肿瘤的第三位。尽管肝癌的诊疗技术在不断的提高,但因肝癌发病因素复杂、易发生转移、对化疗不敏感和手术切除后易复发等原因,肝癌患者的整体生存率仍然不高。因此,深入肝癌发生发展的相关分子机制研究,寻找新型的潜在的肝癌治疗靶点具有重要的现实意义。着丝粒是染色单体上的蛋白结构体,在染色体分离的过程中起到重要的调控作用,其调节失调或功能紊乱会导致非整倍体的出现和促进肿瘤的发生。着丝粒至少由80种不同的着丝粒蛋白组成,包括着丝粒蛋白A、B、C、I、K和M等,在肿瘤发生发展中起到重要的作用。着丝粒蛋白K(Centromere protein K,CENPK)是着丝粒蛋白家族成员之一,在维持着丝粒的功能和有丝分裂过程中可以起到重要的作用。研究发现,CENPK在多种肿瘤中表达上调,并与肿瘤的恶性进展相关,可能扮演着致癌基因的角色。然而,CENPK在肝癌中表达情况及临床意义尚不明确,其具有的生物学功能和相关机制也有待进一步深入探索。因此,本研究的主要目的是探讨CENPK在肝癌中的表达及其相关的功能和机制。【实验目的】1.探讨CENPK在肝癌中的表达情况及临床意义;2.研究CENPK对肝癌细胞恶性生物学功能的影响;3.探讨CENPK调控肝癌细胞恶性改变的相关机制。【实验方法】1.首先在TCGA数据库统计分析CENPK在肝癌中的表达情况及临床意义,然后在临床收集的肝癌标本上利用荧光实时定量PCR和Western Blot方法检测CENPK的表达,对TCGA的结果进行进一步验证;2.构建CENPK干扰病毒载体,感染肝癌细胞系,建立稳定下调CENPK表达和对照组NC的肝癌细胞。通过Celigo细胞计数、CCK-8、平板克隆形成、划痕以及Transwell实验检测CENPK对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;通过裸鼠皮下成瘤实验,在体内检测CENPK对肝癌细胞增殖能力的影响;3.利用基因芯片技术筛选稳定下调CENPK表达组和对照组NC肝癌细胞BEL-7404之间差异的基因表达谱,通过IPA分析获得CENPK调控的关键通路分子,然后通过荧光实时定量PCR、Western Blot和细胞免疫荧光方法进行验证;利用YAP1干扰病毒下调肝癌细胞中YAP1的表达,观察下调YAP1的表达后肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的改变。在CENPK稳定下调的肝癌细胞SMMC-7721中过表达YAP1后观察肝癌细胞的功能恢复情况。进一步通过Western Blot方法检测CENPK和YAP1对EMT标志物表达的影响。【实验结果】1.TCGA数据库中显示,CENPK在肝癌组织中表达升高,与临床分级、T分期、病理分期和患者预后相关;在本科室收集的肝癌组织和相对应的癌旁组织样本中证实CENPK的mRNA水平在肝癌组织中表达增高(86.7%,26/30),蛋白水平也在肝癌组织中表达增高(75%,6/8)。2.成功构建CENPK干扰慢病毒载体并感染肝癌细胞系BEL-7404和SMMC-7721,构建稳定下调CENPK的肝癌细胞;通过Celigo细胞计数、CCK-8、平板克隆形成和裸鼠皮下成瘤实验证实下调CENPK的表达后能够抑制肝癌细胞的增殖能力;通过划痕以及Transwell实验证实下调CENPK的表达后能够抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力;3.基因芯片数据分析结果显示,CENPK主要与恶性实体瘤、肿瘤生长、肿瘤细胞增殖、干细胞增殖、肿瘤细胞侵袭、细胞侵袭和上皮组织的发育等疾病或功能相关,YAP1可能在CENPK参与调控肝癌恶性进展中起到重要的作用;荧光实时定量PCR、Western Blot和细胞免疫荧光方法证实下调CENPK的表达后肝癌细胞中YAP1的mRNA和蛋白的表达均降低;4.利用YAP1干扰病毒能够成功下调肝癌细胞中YAP1的表达,下调YAP1的表达能够抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,可以部分模拟下调CENPK对肝癌恶性进展的抑制作用,而过表达YAP1的表达后能够部分恢复下调CENPK所起到的抑制效应;5.Western Blot实验结果表明,下调CENPK和YAP1的表达后都能够上调上皮标志物E-cadherin的表达,而降低间质标志物N-cadherin的表达;在稳定下调CENPK表达的肝癌细胞SMMC-7721中过表达YAP1后,可以部分逆转下调CENPK所引起的EMT的抑制效应。【结论】1.CENPK在肝癌组织表达增高,与肝癌的恶性表型及预后相关;2.下调CENPK的表达能够在体内外水平抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力;3.下调CENPK的表达能够抑制肝癌细胞的EMT过程,过表达YAP1后能部分恢复抑制EMT的作用;4.CENPK可以通过调控YAP1的表达影响肝癌的恶性进展。靶向作用于CENPK/YAP1可以为肝癌的治疗提供新的思路。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

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空军军医大学博士学位论文-16-图1. 肝癌诊断路线图理有据，避免不合适过度医疗。此外也要注意手术后的治疗，延长转移复发的时间，提高患者的生存质量。局部消融治疗为中晚期不耐受手术切除的肝癌患者提供了新的治疗手段，使其可能获得根治的机会。常见消融手段包括射频消融（RFA）、微波消融（MWA）和无水乙醇注射治疗（PEI）等。TACE治疗目前在临床上应用广泛，这就要求我们临床工作者必须严格按照介入疗法的基本原则进行操作，准确把握其适应症和禁忌症，对术后发生的不良反应要积极对症治疗。放疗多为姑息性治疗，可能会使肝癌患者获得手术切除的机会，也可以延缓肝癌的进展，相对提高患者的生存质量。全身治疗可以联合以上治疗手段或单独使用来改善肝癌患者肿瘤相关症状，延长生存时间。主要包括抗肿瘤治疗、抗病毒治疗和对症治疗。抗肿瘤治疗包括分子靶向药物（索拉非尼）、系统化疗（阿霉素、顺铂等）、免疫治疗（干扰素α、胸腺法新等）、中医药治疗（槐耳颗粒、华蟾素等）等；抗病毒治疗在整个肝癌治疗的过程中都应该积极使用

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空军军医大学博士学位论文-17-图2. 肝癌临床分期及治疗线路图4. 肝癌治疗的新进展目前手术切除、肝移植和射频消融术是认可的具有明确效果的肝癌治愈性手段[50]。近年来随着研究的深入，在化学治疗、免疫治疗和分子靶向治疗等方面也取得了一些新的进展。在手术切除或者肝移植术后使用小分子靶向药物进行系统性全身化疗已被广泛应用，特别适用于经导管肝动脉化疗栓塞失败的患者[51]。但是，肝癌化疗依然存在着剂量限制性、多重耐药性等弊端[52]。在应用于全身治疗肝癌的各种多激酶抑制剂中，索拉非尼是唯一被FDA批准的用于治疗晚期肝癌的药物[53]。研究表明，单用索拉非尼药物治疗的肝癌患者可以延长总生存期3个月，延缓了进展成为晚期肝癌的时间[54]。索拉非尼可以通过靶向抑制多种基因（VEGF-1/2/3、PDGFR-β、Raf和RET等）进而起到抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤增殖的作用，适用于手术切除和射频消融术后患者的辅助治疗。瑞格非尼是索拉非尼的氟衍生物

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空军军医大学博士学位论文-22-图3. 肿瘤细胞YAP/TAZ功能示意图Zanconato F, et al. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 20162. YAP/TAZ在常见肿瘤中的表达及特性2.1 肺癌肺癌包括几种类型，通常将肺腺癌（LAC）、肺鳞状细胞癌（LSCC）、大细胞肺癌定义为非小细胞肺癌（NSCLC）。免疫组织化学研究结果表明，YAP或TAZ在肿瘤组织中表达升高，并与肿瘤组织学分级、TNM分期、淋巴结转移及患者预后不良息息相关[105-108]。在转基因小鼠模型中研究发现，在通过致癌基因KRas的激活和Tp53（或Lkb1）等位基因缺失共同诱导的转移性肺腺癌模型中可以发现高水平的YAP/TAZ定位于细胞核中[109, 110]。Zhang等研究发现从基因水平上降低YAP的表达能够明显减少在KrasG12D、Lkb1L/L小鼠模型中所形成的肿瘤的数量，更有趣的是所形成的病灶大多数是良性的，而且不会发展成为肺腺癌或肺鳞状细胞癌；YAP/TAZ的激活自身可能不足以促进NSCLC的形成：在小鼠气道上皮中具有表达活性的YAP仅能引起组织增生，其本身不足以引发肿瘤的形成[110]。然而

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