IL-33在食管鳞癌中表达的临床意义及其作用机制研究

发布时间：2020-07-26 22:37

【摘要】：研究背景和目的:食管癌是全球范围内较为常见的消化道恶性肿瘤,居全球恶性肿瘤发病率的第8位,死亡率的第6位,严重危害人类健康。食管癌主要有两种组织学类型,食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC),两者的发病和地区分布有显著的地区差别,我国以食管鳞癌为主,占所有食管癌的90%以上。尽管近些年来针对恶性肿瘤的靶向治疗、免疫治疗等取得长足进步,但除手术和放化疗外,针对食管癌尚缺乏循证医学证据证实的有效分子靶向或免疫治疗手段,因此研究食管癌发生或发展的分子机制,为食管癌治疗药物的研发奠定基础,就变得极其重要。白细胞介素-33(Interleukin-33,IL-33)是新近发现的具有多种功效的细胞因子,因其基因序列与白细胞介素-1β(IL-1 β)和白细胞介素-18的序列相似,故被归为IL-1家族成员。IL-33可作为分泌性细胞因子与孤儿受体ST2结合发挥作用,也可以定位于细胞核内发挥转录因子的作用。现阶段有关IL-33在肿瘤,尤其是食管鳞癌发生发展中的作用尚未完全阐明。肿瘤微环境中,趋化因子是一类小分子量的、参与炎症细胞或免疫细胞定向迁移的免疫调节因子,在肿瘤细胞的发生发展中发挥重要作用。CCL2又称MCP-1(monocyte chemotactic protein 1),其主要作用是诱导血液中的单核细胞定向迁移,但其受体CCR2已在多种组织细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞等)和肿瘤细胞中被发现,因而CCL2可直接促进表达CCR2蛋白的肿瘤增殖侵袭,也可招募周围组织细胞参与肿瘤微环境的形成而间接发挥作用。Treg细胞是一群能够调控机体免疫功能的细胞亚群,其对机体免疫系统有着非常重要的影响,在肿瘤微环境中,免疫抑制和免疫激活之间的存在着不平衡,Treg细胞在肿瘤微环境中对抗肿瘤的免疫反应起到抑制作用,促进肿瘤细胞的免疫逃逸,已有一些研究显示CCL2在肿瘤微环境中与Treg细胞的招募密切相.关。我们的研究主要分为三部分。我们首先在临床组织标本中验证了 IL-33与食管鳞癌患者的临床病理参数之间的关系,接着在细胞实验中研究IL-33基因对食管鳞癌细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学作用,在动物实验中探究了 IL-33基因对食管鳞癌细胞增殖能力的影响,最后深入探讨了 IL-33作为一种分泌性细胞因子与肿瘤微环境中的趋化因子CCL2和免疫抑制性细胞Treg细胞之间的关系,揭示了 IL-33影响食管鳞癌发生发展的机制。第一部分 IL-33在食管鳞癌患者中的表达及其临床意义的分析方法:1)用Real time PCR检测IL-33在食管鳞癌组织及癌旁组织中的mRNA表达水平并分析其与食管鳞癌患者临床参数的相关性。2)用免疫组化的方法检测食管鳞癌组织中IL-33的蛋白表达水平与患者临床病理参数的关系。3)用Real time PCR及免疫组化方法检测IL-33的表达水平与食管鳞癌患者预后的关系。结果:1)食管鳞癌组织中IL-33的mRNA的表达水平显著高于癌旁组织,差异有统计学意义。且食管鳞癌的分期越高,分化程度越差,其肿瘤组织中IL-33 mRNA水平越高。2)IL-33的蛋白表达水平在食管鳞癌组织中显著高于癌旁组织,且IL-33蛋白表达水平与患者的肿瘤分化程度、肿瘤分期、肿瘤的侵袭程度以及患者的生存显著相关,而与患者的年龄性别及是否有淋巴结转移无显著相关性。3)IL-33 mRNA或蛋白高表达的患者组总生存率较低,而IL-33低表达和不表达的食管鳞癌患者的生存率相对较高,结果具有显著的统计学差异。小结1)IL-33在食管鳞癌患者肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织,IL-33的mRNA及蛋白表达水平与患者的临床分期和临床参数相关,提示IL-33在食管鳞癌的发生发展中起到重要的作用。2)IL-33的表达与食管鳞癌患者的肿瘤分化、分期、侵袭程度相关,与食管鳞癌患者生存期显著相关,即IL-33高表达与患者的总生存时间呈负相关,由此推断IL-33可以作为判断食管鳞癌患者预后的指标。第二部分IL-33对食管鳞癌细胞生物学行为的影响方法:1)利用Real time PCR的方法检测IL-33 mRNA在多株食管鳞癌细胞中的表达差异。2)利用CCK-8实验以及克隆形成实验观察过表达IL-33的食管鳞癌细胞增殖能力的变化。3)利用划痕实验和Transwell实验检测过表达IL-33对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。4)利用CCK-8实验以及克隆形成实验观察敲低IL-33的食管鳞癌细胞增殖能力的变化。5)利用划痕实验和Transwell实验检测敲低IL-33对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。6)动物实验检测IL-33过表达对裸鼠的食管鳞癌皮下移植瘤的影响。7)动物实验检测IL-33敲低对裸鼠的食管鳞癌皮下移植瘤的影响。结果:1)IL-33mRNA在EC109细胞中表达相对最高,在KYSE450细胞中表达相对最低,因而在过表达IL-33的细胞实验中选择KYSE450细胞做病毒转染,在敲低IL-33的细胞实验中选择EC109细胞做病毒转染。2)过表达IL-33对食管鳞癌细胞的增殖能力无明显影响。3)过表达IL-33促进了食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力。4)敲低IL-33对食管鳞癌细胞的增殖能力无明显影响。5)敲低IL-33抑制了食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力。6)过表达IL-33促进裸鼠的食管鳞癌移植瘤的生长。7)敲低IL-33抑制了裸鼠的食管鳞癌移植瘤的生长。小结1)在食管鳞癌细胞中过表达或敲低IL-33对细胞的增殖能力没有影响,而对食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力有显著影响。2)在食管鳞癌细胞中过表达或敲低IL-33可影响裸鼠皮下成瘤的体积大小,提示IL-33在体内可影响食管鳞癌的增殖。3)细胞实验和动物实验结果的不同可能与IL-33在肿瘤微环境中发挥重要生物学作用有关。第三部分IL-33影响食管鳞癌细胞增殖和侵袭迁移的机制研究方法:1)用Cytometric Bead Array及ELISA的方法进行检验过表达IL-33或敲低IL-33后细胞上清中细胞因子的变化。2)用Realtime PCR检测IL-33与CCL2在裸鼠皮下肿瘤组织中的表达量,在ST2基因敲低的细胞和未敲低ST2的食管鳞癌细胞中加入外源性的IL-33,使用Real timePCR和ELISA检测CCL2的表达量。从TCGA数据库中下载数据验证IL-33与CCL2的关系。3)用Westernblot的方法探究在食管鳞癌细胞中IL-33调控CCL2表达的信号通路。4)用流式细胞术以及transwell系统探究CCL2对食管鳞癌细胞肿瘤微环境中Treg细胞的趋化作用。5)用Realtime PCR检测小鼠皮下成瘤组织中上皮间质转化(EMT)相关的分子N-CAD、ZEB2、VIM、slug的表达量,初步探讨IL-33促进食管鳞癌侵袭转移的机制。结果:1)在过表达和敲低IL-33的食管鳞癌细胞上清中表达量与对照组相比差异最大的就是CCL2,提示CCL2可能参与IL-33发挥生物学效应的过程。2)在过表达IL-33的肿瘤组织中,CCL2的表达量也显著增高;在敲低IL-33的肿瘤组织中,CCL2的表达量也显著下降。在未敲低ST2基因的食管鳞癌细胞中,加入外源性的IL-33可使得CCL2的mRNA及蛋白表达明显升高,差异与加入IL-33之前相比有显著统计学意义。而敲低IL-33的受体ST2以后再加入外源性的IL-33,食管鳞癌细胞中CCL2的mRNA和蛋白的表达相比于加入IL-33之前只轻微升高,差异无统计学意义。TCGA数据库分析结果也显示,IL-33与CCL2的表达呈显著正相关。3)抑制NF-κB通路后CCL2的表达量也显著下降,加入外源性IL-33后NF-κB通路显著被激活,而在食管鳞癌细胞中敲低IL-33的受体ST2后,NF-κB通路的激活被抑制,CCL2的表达量也随之下降。4)CCL2对Treg细胞有趋化作用,CCL2可招募Treg细胞在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用,进而促进食管鳞癌细胞的免疫逃逸和增殖。5)N-CAD、ZEB2、VIM、slug的mRNA表达水平在shIL-33组裸鼠肿瘤组织中明显低于NC组皮下肿瘤,差异具有统计学意义。小结1)IL-33可通过结合其受体ST2,并通过NF-κB信号通路促进CCL2的表达。2)CCL2可招募免疫抑制性的Treg细胞进入食管鳞癌微环境中,进而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。IL-33促进食管鳞癌发生发展的机制可能是通过促进CCL2的表达来招募Treg细胞而发挥作用的。3)IL-33促进食管鳞癌侵袭转移的机制可能与促进上皮间质转化有关,其中的具体机制尚待进一步深入探讨。结论1)IL-33在食管鳞癌患者肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织,IL-33的表达水平与患者的临床分期和临床参数相关,IL-33可以作为判断食管鳞癌患者预后的指标。2)IL-33基因对食管鳞癌细胞的增殖能力没有影响,而对食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力有显著影响,其机制可能与上皮间质转化相关。3)IL-33可通过NF-κB信号通路促进CCL2的分泌,进而招募Treg细胞,促进肿瘤的免疫逃逸,进而促进肿瘤的发生发展。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1
【图文】：

表达水平,食管,癌组织,食管鳞癌

并用Ｒｅａｌｔｉｍｅ邋ＰＣＲ检测ｆ邋ＩＬ－３３邋ｍＲＮＡ的表达水平，结果显示食管逡逑鳞癌组织中丨Ｌ－３３的ｍＲＮＡ的表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义逡逑（ｐ＝０．０００６）（如图１．１Ａ）。８７例食管鳞癌患者的临床分期为Ｔ１期６例，Ｔ２期为逡逑３８例，Ｔ３期为４３例，如（图１．１Ｂ）；且食管鳞癌的分期越高，分化程度越差，逡逑其肿瘤组织中丨Ｌ－３３ｍＲＮＡ平越高，差异均有统计学意义如（图ｉ．１Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑§４０－．逦Ｐ＝０．０００６逡逑１邋３０－逦＇逦－４逦ｔ邋＇逦＇逦逦逦Ｈ逡逑Ｉ－逦Ａ逦—ｆ邋ｉ邋！邋！１邋－４＾＾逡逑ｒ°Ｊ逦＾逦§１逦１逦＾｜；邋ｐｉ，邋丁逡逑丨丨ｉ逦■逦．邋ｗｉ邋ｔ逡逑Ａｄｊａｃｅｎｔ逦Ｔｕｍｏｒ逦Ｐｏｏｒ逦Ｗｅｌｌ逡逑图１．１食管鳞癌组织及癌旁组织中的ＩＬ－３３的表达逡逑Ａ．８７例食管淲癌组织中ＩＬ－３３的ｍＲＮＡ的表达水平显著高于癌旁组织，逡逑（Ｐ＝０．０００６）；逡逑Ｂ邋．丨Ｌ－３３的ｍＲＮＡ表达水平在不同分期食管鳞癌组织中的表达（＊ｐ＜0．0５）：逡逑Ｃ．ＩＬ－３３的ｍＲＮＡ表达水平在不同分化程度的食管鳞癌组织中的表达（＊丨ｙｏ邋ｏｓ）。逡逑３．２食管鳞癌及癌旁组织中ＩＬ－３３蛋白的表达水平逡逑为进一步了解１Ｌ－３３的蛋白表达水平，我们通过免疫组化的方法检测了食管逡逑鳞癌患者鳞癌组织和癌旁组织中ＩＬ－３３蛋白的表达（如图１．２Ａ）。从染色结果可逡逑以看出丨Ｌ－３３蛋白－般在细胞质和细胞膜表面表达，８７例患者的食管鳞癌组织逡逑中，ＩＬ－３３蛋白的阳性表达率为７４．７１％（６５／８７），即ＩＬ－３３高表达的食管鳞癌患者逡逑经统计为６５例

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ＴＥ７细胞中ＲＮＡ进行提取并对ＩＬ－３３ｍＲＮＡ表达水平进行检测比较，结果发现逡逑ＩＬ－３３邋ｍＲＮＡ在ＥＣ１０９细胞中表达相对最高，在ＫＹＳＥ４５０细胞中表达相对最逡逑低（如图２．１Ａ），邋ＰＣ０．０５，差异具有统计学意义，后又对这些ＰＣＲ结果展开蛋白逡逑水平的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ验证（如图２．１Ｂ）。通过这部分研究，我们就选择了邋ＫＹＳＥ４５０逡逑细胞作为过表达ＩＬ－３３的目的细胞，选择ＥＣ１０９细胞作为稳定敲低ＩＬ－３３的目的逡逑细胞。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑Ｚ逡逑Ｅ｜0邋｜逡逑？ｇ＊５邋Ｉ邋［ＩＩ邋１１逦４今、、？逡逑■５邋0邋幨圈逦U澹樱颍危保币唬颍睿恚礤义希欤椋幔悖簦酰殄澹埃埃掊危恚簦恚礤危恚恚礤义希桑蹋常冲义希牵粒校模儒义贤迹玻卞澹桑猓常冲澹恚遥危猎谑彻軠W癌细胞中的表达逡逑Ａ．逦Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ的方法检测实验室永生化食管淲癌细胞Ｈｅｔ－１邋ａ及其它食管鳞癌细胞逡逑中丨Ｌ－３３ｍＲＮＡ表达水平并用ＰＣＲ验证（ＰＣ０．０５）；逡逑Ｂ．逦Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ验证以上细胞中丨Ｌ－３３的表达水平。逡逑３．２过表达ＩＬ－３３的食管淲癌细胞增殖能力的变化。逡逑因为ＫＹＳＥ４５０细胞的ＩＬ－３３的表达量相对最低，所以选择在该细胞中转染逡逑ＩＬ３３过表达载体。转染ＫＹＳＥ４５０细胞后流式分选并获得阳性细胞，接着我们通逡逑过Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ方法检测ＩＬ－３３的过表达效果（如图２．２Ａ）。结果显示，与空逡逑载体对照组（ＯＥ－ＮＣ）相比，转染过表达ＩＬ－３３慢病毒的ＯＥ－ＩＬ－３３细胞ＩＬ－３３逡逑ｍＲＮＡ的表达水平明显升高

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逦ＮＣ逦ＯＥＬ－３３逡逑图２．３过表达１Ｌ－３３促进了食管淲癌细胞的侵袭迁移能力逡逑Ａ．ＯＥ－ＮＣ细胞中，细胞的侵袭能力明显低于对照的ＯＥ－１Ｌ－３３组（＊＊＊Ｐ＜０．００１）；逡逑Ｂ邋．过表达１Ｌ－３３促进了食管＾癌细胞的迁移能力。逡逑３．４稳定敲低ＩＬ－３３的食管淲癌细胞的构建逡逑在３．１部分的研究中，我们发现ＥＣ１０９细胞相对于实验室其它细胞表达ＩＬ－３３逡逑最高，于是在此部分的研宄中我们选择ＥＣ１０９作为敲低ＩＬ－３３的细胞，并建立逡逑了稳定转染细胞ｓｈＩＬ－３３，为后续实验做准备。结果如图２．４所示，流式细胞术逡逑检测转染阳性的细胞，结果提示慢病毒转染效率为９５．１％邋（图２．４Ａ），进一步逡逑地，我们通过Ｒｅａｌ邋Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ和ｗｅｓｔｅｒｎ检测验证了邋ＩＬ－３３的稳定敲低（图２．４Ｂ）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑Ｅ逦｜｜？ｉ逦邋Ｉ邋１１逦令0邋／逡逑９５．１％逦《９３．５％逦＾逦１逦一一逡逑＾邋＼逦Ｉ逦—｜￣逦ｍｍｍ邋ｍｍｍ邋ａｃｔｉｎ逡逑Ｊ｜．邋－ｖ逦

【参考文献】