RBPJ在成人T淋巴细胞白血病中的作用及机理的研究

发布时间：2020-07-28 12:27

【摘要】：人类T淋巴细胞白血病I型病毒(HTLV-1)是成人T淋巴细胞白血病(ATL)的致病病原。研究证实,HTLV-1通过其自身编码的病毒蛋白参与宿主细胞内多种信号通路的调节,影响肿瘤细胞的增殖与ATL的发生。临床检测报道显示,在ATL中Notch1通路异常激活,且抑制Notch1介导的信号通路能够显著抑制ATL细胞的增殖与肿瘤的形成。RBPJ作为Notch1信号通路中一种重要的转录因子,在Notch1信号通路的激活中发挥重要作用。然而迄今,RBPJ参与的Notch1信号通路在ATL发生过程中的作用与机制尚不清楚。为了探索RBPJ在ATL中的表达及其作用,本研究将从分子、细胞以及动物水平探究RBPJ在ATL细胞增殖与迁移中的作用,揭示RBPJ影响ATL细胞增殖与迁移的分子机制。本研究的主要内容如下:第一部分:探讨RBPJ在HTLV-1感染细胞株中表达与调控机制采用Real-time PCR技术与蛋白质免疫印迹技术检测HTLV-1感染阴性与阳性细胞中RBPJ表达情况,发现RBPJ在HTLV-1感染阳性细胞中普遍高表达;进一步研究发现,ATL中RBPJ的表达与病毒蛋白p30表达呈明显正相关。实验结果表明,在HTLV-1感染细胞中,RBPJ的过表达可能受病毒蛋白p30表达的调控。第二部分:研究RBPJ在ATL细胞增殖与迁移中的作用以HTLV-1阳性细胞株ATL-T为研究材料,建立RBPJ沉默稳定表达细胞系,采用Real-time PCR与Western blot方法检测RBPJ沉默效果与病毒蛋白的表达,实验显示沉默ATL细胞中RBPJ的表达并不影响病毒核心抗原的表达。采用CCK-8实验与流式细胞术检测细胞增殖与周期分布,结果发现沉默RBPJ后细胞增殖能力受到明显抑制,且细胞周期主要阻滞在G1期。Trans-well检测结果显示,沉默ATL细胞中RBPJ后,细胞迁移能力明显下降。动物实验进一步研究证实,沉默RBPJ的表达能够显著抑制ATL细胞的小鼠皮下成瘤效果。第三部分:探究RBPJ影响ATL细胞增殖与迁移的分子机制采用Real-time PCR与Western blot检测沉默稳定株中,周期监测点与EMT途径中基因与蛋白的表达。发现沉默ATL细胞中RBPJ后,细胞周期依赖的激酶4、6,细胞周期蛋白D2、D3、E1以及磷酸化Rb的表达明显降低;EMT途径中E-Cadherin表达升高,而TCF-8,Snail,N-Cadherin,β-Catenin等蛋白表达下降;同样,这些基因的表达在动物实验中也得到相同结果。综上所述,本研究首次发现HTLV-1的病毒蛋白p30通过激活RBPJ的表达,并影响细胞周期调控蛋白与EMT家族蛋白表达,进而导致ATL的发生。本研究揭示了RBPJ在ATL发生过程中的调控作用,初步阐明了RBPJ影响细胞增殖与迁移的可能分子机制。为人们更好的认识ATL的发病机制提供理论依据,为HTLV-1感染类疾病的治疗提供新的靶点。
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.7
【图文】：

感染者,潜伏感染,长末端重复序列,十面体

感染者的发病率仅有 5%，但是由于死亡率高和预后差，并且目前没有有效的疗方案使得 HTLV-1 已经严重危害着人们的生命。自 1977 日本学者 Bethesda次报道 HTLV-1 感染者以来，全球 HTLV-1 感染者的人数突破 2000 万，而亚地区成为 HTLV-1 感染的高发区[2, 3]。我国学者先后于十多个东南沿海的省市现 HTLV-1 感染患者[4-11]。并且在福建、广东及台湾等地区呈现出流行性。目由于人口的流动性增加将导致 HTLV-1 的感染者逐年增多[6, 12]。HTLV-1 为二十面体的球型结构，外面为病毒的衣壳，里面为 RNA 和蛋白组成的核心颗粒，直径约为 100nm。与其他逆转录病毒一样，HTLV-1 前病毒因组由两端的长末端重复序列（LTR），Gag、Pol、Env 三个结构基因和 px 区构成。px 区域正向编码 Tax、Rex、p30、p21、和 pP8 及反向编码的 HBZ 等调蛋白 (如图 1.1)[1]。这些病毒编码的调控蛋白能够调控宿主细胞内的诸如 AP1，-κB，CREB 等信号通通路，在 HTLV-1 感染，细胞与细胞之间的传播，病毒潜伏感染，病毒基因的复制及 ATL 及 HAN/TSP 等疾病的发生中均发挥着极为要的作用[13, 14]。

病毒蛋白

.6.6 p30 蛋白的结构特征p30 蛋白是由 HTLV-1 病毒基因组 PX 区编码的由 241 个氨基酸构成的，量为 30 kDa 的，与 HTLV-1 病毒的潜伏关系密切的调控蛋白[49]。1992 年有两个独立的研究团队相继在 HTLV-1 感染性细胞株发现能够编个分子量为 30 kDa 的成熟的 HTLV-1 mRNA[50]。其中，Koralnik 团队发现nv/Tax 相同的起始密码子 AUG 能够编码一条分子量为 30 kDa 的蛋白；与此，D’Agostino 发现一条不依赖于 Env/Tax 起始密码子 AUG 而独立起始编码量为 30kDa 的病毒蛋白，且位于其碳端的 87 个氨基酸即为另一个病毒调控 p13。随后，研究人员有相继在 HTLV-1 阳性细胞、ATL 和 HAM/TSP 病品中分别在基因及蛋白水平上相继检测到编码 p30 mRNA 及 p30 蛋白。如图 1.2 所示，p30 蛋白按其功能可以分为 3 个区域：核定位区（NLS）ex 蛋白结合区及 PDZ 结合区[51]。Ghorbel 团队通过免疫荧光技术检测到 p30 聚集在细胞核，这说明 p30 极可能作为一个转录因子直接参与调控宿主细胞通路。另外，p30 蛋白等电点为 11.71，而大量的正电荷有效的促进了 p30 酸的结合能力。

三次,PVDF膜,脱脂奶粉,室温

(4) 盖上盖子，根据目的蛋白分子量的大小设置转膜的时间及电压的大小.5.6 免疫印迹分析(1) PVDF封闭：转膜结束后取出PVDF膜立即用PBST清洗三次，每次在摇摇动三次，后加入5%的脱脂奶粉放于摇床上封闭3 h；(2) 一抗的孵育：封闭结束后，PBST清洗三次每次10 min；按Marker和目白的大小，裁剪PVDF膜，加入相应的抗体，室温孵育2 h；(3) 洗膜：孵育结束后PBST清洗三次每次10 min；(4) 二抗的孵育：清洗后，加上相应的二抗，室温孵育1.5 h；(5) 洗膜：孵育结束后PBST清洗三次每次10 min；(6) 检测：将含有目的条带的PVDF膜敷上发光液，曝光显影。4 实验结果.1 RBPJ 在 HTLV-1 阳性细胞株中高表达

【参考文献】