miR-494抑制胰腺癌细胞增殖和迁移能力的研究

发布时间：2020-07-28 14:09

【摘要】：胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)是一种高度恶性、高侵袭性消化系统肿瘤,目前治疗效果欠佳,5年生存率仍然很低,多数报道在5%～10%。胰腺癌患者发病早期的临床表现不典型,症状隐匿,约80%的患者在确诊时已发生远处转移,因此错过了最佳手术治疗时机,只有不足20%的病人有机会接受根治性切除手术,且胰腺癌患者对一般的化疗药物易出现耐药性,对放疗的敏感性亦差强人意,严重影响了胰腺癌患者治疗效果。因此寻找胰腺癌发生、发展过程中有效的诊断和治疗靶标成为目前研究的重点。microRNAs(miRNAs)是一类长度为19-24个核酸的非编码单链RNA,它可通过转录后调控促使目标基因mRNA发生降解或转录抑制。研究显示microRNAs在癌症的发生、发展、侵袭及耐药过程中发挥着重要的调控作用,提示miRNAs在肿瘤诊断、预后评价及治疗等方面有着较高的应用价值。miR-494是由位于染色体14q32.31上的基因所编码,研究认为miR-494具有抑癌基因作用,在多种癌症组织中均可检测到miR-494表达水平的下调,如胃癌、胆管癌、淋巴癌及肺癌等。Olaru等发现miR-494可与CDK6的3'-UTR区结合引起胆管癌细胞周期阻滞,抑制其增殖。在胰腺癌中,刘洋等证实miR-494可通过靶向c-Myc和SIRT1发挥促胰腺癌细胞凋亡作用,此外,miR-494还可增强胰腺癌细胞对5-Fu和GEM药物敏感性,提示miR-494可作为胰腺癌基因治疗的潜在靶点。锌指蛋白Gli3是Sonic Hedgehog(SHH)信号下游转录因子,研究显示Gli3在肿瘤发生发展及侵袭迁移过程中发挥重要作用,它可通过SHH信号通路直接与抗凋亡因子启动子结合发挥抗凋亡作用。Hironori Iwasaki等发现低分化结肠癌患者组织Gli3阳性率明显高于中高分化组,给予小鼠注射Gli3过表达DLD-1细胞可促肿瘤形成,提示Gli3可能有促直肠癌发生作用。文善云等证实宫颈癌中抑癌因子miR-506与Gli3表达呈负相关性,瞬转si-Gli3可使宫颈癌细胞的增殖活性减弱,而外源性导入Gli3基因可拮抗miR-506对宫颈癌细胞的抑制作用,表明G1 i3在宫颈癌发生过程中可能具有类似原癌基因效果。此外,Gli3还可间接启动上皮间质细胞转化,交联SHH-EMT信号促进肿瘤细胞的侵袭和转移。我们应用TargetScan、miRbase和miRanda生物信息学软件预测Gli3可能是miR-494的潜在靶点,由此我们推测,miR-494可能通过干预Gli3转录参与调控胰腺癌的发生发展。本研究应用免疫组化、分子生物学及靶向基因调控技术探讨miR-494在胰腺癌进展恶化中的可能作用,阐明了miR-494在胰腺癌病理过程中的作用机制,为今后胰腺癌的临床诊断及靶向治疗提供理论和数据支持。研究目的明确胰腺癌患者胰腺癌组织和癌旁正常组织miR-494 mRNA表达水平,分析miR-494 mRNA表达水平与胰腺癌患者临床指标及预后相关性;探讨胰腺癌患者组织内Gli3 mRNA及蛋白表达水平,分析Gli3与miR-494及患者临床特征的相关性;验证miR-494对Gli3的靶向调控作用,探讨miR-494与Gli3在胰腺癌发生发展及侵袭转移过程中的调控机制。研究方法1.收集胰腺癌组织及配对癌旁正常组织共99例,荧光定量PCR法检测组织中miR-494 mRNA表达水平,分析miR-494与患者临床病理特征及预后相关性,Cox比例风险模型分析胰腺癌OS影响因素;2.荧光定量PCR法及Western-blot法检测胰腺癌患者组织中Gli3 mRNA及蛋白表达水平,分析Gli3 mRNA与患者临床病理特征及miR-494表达相关性;3.给予胰腺癌细胞PANC-1转染hsa-miR-494mimics/inhibitor,干预PANC-1 细胞miR-494表达水平,CCK-8和Transwell法检测转染细胞增殖和迁移活性,双荧光素酶报告基因实验验证miR-494对Gli3的靶向调控作用。结果1.胰腺癌患者病灶组织内miR-494 mRNA表达水平明显低于癌旁正常组织(p0.05),其mRNA相对表达量分别为(0.48±0.11)和(1.80±0.28)。参照胰腺癌组织中miR-494 mRNA相对表达量,选定中位值作为截断点,将99例胰腺癌患者划分为miR-494低表达组和miR-494高表达组,用于临床病理相关性分析。2.miR-494表达水平与胰腺癌患者淋巴转移、远处转移、血管侵袭、TNM分期及分化程度密切相关(p0.05),与患者的年龄、肿瘤大小和性别无明显相关性。3.miR-494高表达组和低表达组5年生存率分别为49.2%和12.0%;与miR-494低表达组患者相比,miR-494高表达组患者有着更长生存时间(p0.05),提示miR-494表达水平与胰腺癌预后相关。4.性别、年龄、肿瘤大小、位置、分化程度不是OS的独立危险因素。淋巴结转移(HR=2.92,95%CI= 1.37-10.39,P=0.016)、血管侵袭(HR=2.18,95%CI=1.03-16.86,P=0.008)、远处转移(HR=3.03,95%CI= 2.15-18.92,P=0.012)、TNM 分期(HR=2.98,95%CI= 1.88-14.12,P=0.007)、miR-494 mRNA 表达(HR=2.85,95%CI=1.54-8.45,P=0.019)为胰腺癌患者预后OS的独立影响因素,表明miR-494可用于胰腺癌总生存期的预测。5.99例胰腺癌患者组中,Gli3 mRNA阳性表达病例数为45例(45.5%),癌旁组织中Gli3 mRNA阳性表达病例数为9例(9.1%)。胰腺癌患者病灶组织内Gli3 mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织(p0.05),其mRNA相对表达量分别为(0.68±0.25)和(0.50±0.24)。参照胰腺癌组织中Gli3mRNA相对表达量,将99例胰腺癌患者划分为Gli3阳性表达组和Gli3阴性表达组,用于临床病理相关性分析。6.Western-blot法分析胰腺癌患者病灶组织和癌旁正常组织内Gli3-FL和Gli3R的表达情况,分析Gli3-FL与Gli3R相对蛋白表达水平并探讨二者比值变化,结果显示99例胰腺癌患者组中,Gli3蛋白阳性表达病例数为40例(40.4%),癌旁组织中Gli3蛋白阳性表达病例数为9例(9.1%)。胰腺癌患者病灶组织及癌旁组织Gli3-FL的蛋白表达相对量分别为0.50±0.41和0.34±0.21,与癌旁组织相比,胰腺癌患者病灶组织内Gli3-FL蛋白表达水平显著升高(p0.05),两组间Gli3R表达水平无明显差异,计算Gli3-FL与Gli3R比值,可见胰腺癌患者病灶组织Gli3-FL与Gli3R比值明显高于癌旁正常组织,表明胰腺癌患者组织内Gli3主要以全长形式存在,提示Gli3在胰腺癌的发生发展过程中具有转录激活子作用。7.Gli3mRNA表达水平与患者性别(χ2=0.11,p=0.74)、年龄(χ2=1.75,p=0.19)、肿瘤部位(χ2=0.14,p=0.71)、淋巴结转移(χ2=2.85,p=0.09)、TNM分期(X2=3.26,p=0.07)等临床参数无关,但与血管侵袭(χ2=4.25,p=0.04)、远处转移(χ2=10.43,p=0.001)及分化程度(χ2=4.93,p=0.03)相关,提示发生血管侵袭及远处转移胰腺癌患者组织Gli3 mRNA表达水平显著高于无血管侵袭和远处转移患者,低分化度胰腺癌患者组织Gli3 mRNA表达水平显著高于中高分化患者组。8.Pearson correlation法分析证实胰腺癌癌组织中miR-494与Gli3 mRNA表达具有相关性(r2=0.3119,P=0.004)。9.miR-494 mimics转染后,PANC-1细胞中miR-494 mRNA表达水平显著上调(P0.01),转染 miR-494 inhibitor 后,PANC-1 细胞中 miR-494 mRNA 表达水平明显降低(P0.01),提示miR-494 mimics/inhibitor转染后可有效干预PANC-1细胞中miR-494 mRNA表达水平。10.CCK-8试剂盒检测miR-494 mimics/inhibitor转染后PANC-1细胞增殖活性,miR-494表达上调可显著拮抗PANC-1细胞增殖活性(P0.01),转染inhibitor下调miR-494表达可使PANC-1细胞增殖活性增强(P0.01)。11.应用Transwell细胞体外迁移实验分析miR-494 mimics/inhibitor转染后PANC-1细胞迁移能力,miR-494表达水平上调后PANC-1体外迁移能力下降(P0.01),表明miR-494可抑制胰腺癌细胞PANC-1的体外迁移能力;miR-494表达抑制后,PANC-1迁移能力显著增强(P0.01)。12.利用生物信息学软件(miRanda、TargetScan和miRDB)预测分析miR-494潜在作用靶点,发现miR-494可与Gli3的3'-UTR区结合,我们根据结合位点构建了Gli3 3'-UTR双荧光素酶报告基因质粒,荧光素酶报告基因系统结果显示Gli3的3'-UTR野生型双荧光素酶报告基因质粒与miR-494共转染24 h后,可见其萤光素酶活性降低(P0.05),表明miR-494可直接作用于Gli3的3'-UTR区。结论1.胰腺癌患者病灶组织miR-494 mRNA呈低表达,并与胰腺癌患者淋巴转移、远处转移、血管侵袭、TNM分期及临床病理分型及预后密切相关。2.淋巴结转移、血管侵袭、远处转移、TNM分期、miR-494 mRNA表达为胰腺癌患者预后OS的独立影响因素,检测miR-494水平有助于胰腺癌病人的预后判断。3.Gli3在胰腺癌患者病灶组织呈现高表达,并与患者血管侵袭、远处转移、分化程度正相关,与组织中与miR-494负相关。4.miR-494表达上调可显著拮抗PANC-1细胞增殖和迁移活性,Gli3作为miR-494靶基因之一参与介导了 miR-494对胰腺癌细胞的抑制作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9
【图文】：

细胞迁移,萤光素酶,转染,突变型

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【参考文献】