【摘要】：随着目前对癌前病变及胃癌诊治水平的提高,发达国家胃癌的总体发病率和死亡率较前有所下降,但胃癌依然是全球尤其是东南亚国家高发的恶性肿瘤之一。目前认为胃癌的发生、发展与某些癌基因的激活和/或抑癌基因的失活密切相关,基于此理论发现和验证新的癌基因不仅能够为阐明胃癌可能的发病机制提供一定的理论基础,还有助于发现新的用于胃癌早期诊断的肿瘤标志物。膜联蛋白家族(Annexins,ANXs)是广泛表达于除酵母之外的真核细胞膜和胞质内的Ca2+调节磷脂结合蛋白,其通过调节细胞膜蛋白与其他位于细胞内、细胞核膜和细胞外基质之间蛋白的相互作用而发挥作用。膜联蛋白家族共有A、B、C、D和E五个亚组,A组主要表达于哺乳动物细胞,包括12个成员(A1-A11、A13)。近年来研究发现膜联蛋白A11(ANXA11)与肿瘤的发生及发展有着密切联系,在细胞增殖、迁移和侵袭等生物学过程中起着重要作用。ANXA11的表达水平在卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、胃癌和肝癌中都存在异常。然而,目前关于ANXA11在肿瘤发生发展中更加深入的研究数量相对较少,而在胃癌中可能的作用机制也不明确。本研究以人胃癌组织、不同分化的人胃癌细胞株和通过构建裸鼠皮下移植瘤为研究对象。分别应用常规HE病理染色、免疫组织化学、蛋白印迹法(Western Blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)、细胞划痕实验、CCK-8实验、流式细胞术和Transwell小室等实验方法首先研究了胃癌及癌旁正常组织中ANXA11 m RNA和蛋白的表达差异,并分析ANXA11的表达水平与胃癌患者各项临床和病理数据的关系;然后通过体外实验研究抑制ANXA11后对胃癌细胞AGS和SGC-7901各种生物学行为(如细胞增殖、迁移和侵袭)的影响,最后通过构建能稳定抑制ANXA11的AGS细胞株后观察其在体内对裸鼠皮下移植瘤增殖的影响,探讨了ANXA11在胃癌增殖、侵袭和转移中的作用,从而为更深刻的认识和研究胃癌发生发展的分子机制提供研究基础和方向。第一部分胃癌中膜联蛋白A11的表达及与其临床生物学特性关系的研究目的:验证ANXA11在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达,以及与胃癌患者各项临床和病理参数的关系。方法:1 q PCR、Western Blot和免疫组织化学技术检测63例配对的胃癌组织和癌旁正常胃组织中ANXA11 m RNA和蛋白的表达水平。2分析ANXA11表达水平与胃癌患者各项临床和病理参数的关系。3 q PCR和Western Blot检测4株胃癌细胞和GES-1细胞中ANXA11的表达水平。结果:1.q PCR、Wester Blot和免疫组织化学结果显示:ANXA11在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织,差异具有显著性(P0.05)。2.ANXA11表达上调与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤部位和Borrmann分型无关,而与肿瘤大小、浸润程度、局部淋巴结转移、TNM分期及有无血管侵犯显著相关(P0.05)。3.与GES-1相比,AGS和SGC-7901胃癌细胞株中ANXA11表达升高(P0.05),而其它2株常见的胃癌细胞株MGC-803和BGC-823中ANXA11表达与GES-1未见明显差异。小结:1.ANXA11在胃癌组织中表达显著高于癌旁正常组织。2.ANXA11表达水平的升高与胃癌患者的肿瘤大小、浸润程度、局部淋巴结转移、TNM分期及有无血管侵犯显著相关,可能成为胃癌的肿瘤标志物之一。3.ANXA11 m RNA和蛋白在AGS和SGC-7901胃癌细胞株上高表达,适合体外构建抑制ANXA11的细胞株。第二部分抑制膜联蛋白A11对胃癌细胞AGS和SGC-7901增殖、迁移及侵袭能力的影响目的:研究抑制ANXA11对胃癌细胞AGS和SGC-7901增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法:1构建能有效抑制ANXA11的AGS和SGC-7901胃癌细胞株;2平板克隆形成实验和CCK-8实验观察抑制ANXA11后对AGS和SGC-7901细胞克隆形成和增殖的影响;3采用流式细胞仪检测抑制ANXA11对AGS和SGC-7901细胞周期的影响。4细胞划痕和Transwell实验研究抑制ANXA11后对AGS和SGC-7901细胞迁移和侵袭的影响并利用Western Blot检测抑制AXNA11后对迁移和侵袭相关蛋白表达的影响。5 Western Blot检测抑制ANXA11后对AGS和SGC-7901细胞株AKT/GSK-3β/Cyclin D1信号通路的影响。结果:1.RT-PCR、q PCR结果显示与NC组细胞相比,转染组细胞的ANXA11-m RNA表达水平明显降低,以si RNA1在40n M浓度下效果最为明显。Western Blot结果显示:转染组细胞的ANXA11蛋白表达水平较NC组细胞明显降低,同样是以si RNA1在40n M浓度下效果最为明显(P0.05)。2.平板克隆形成实验结果显示抑制ANXA11后转染组胃癌细胞形成克隆的数量明显少于NC组和空白对照组。CCK-8结果显示NC组和转染组在第0h和第24h的吸光度值(OD值)没有显著差异,而在第48h、第72h和第96h时转染组OD值较NC组显著降低(P0.05)。3.流式细胞术检测结果显示抑制ANXA11表达后,转染组G0/G1期细胞较NC组明显增加(P0.05)。4.细胞划痕实验结果显示与NC组相比,ANXA11转染组细胞的平面迁移活性受到明显抑制(P0.05)。5.Transwell细胞侵袭实验结果显示抑制ANXA11后AGS和SGC-7901细胞通过Transwell小室基质胶的贴壁细胞明显少于NC组(P0.05)。6.抑制ANXA11后转染组MMP-2和MMP-9蛋白表达水平较NC组明显下调(P0.05)。7.抑制ANXA11后转染组和NC组相比AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、PCNA和Cyclin D1蛋白及磷酸化蛋白的表达水平均明显降低(P0.05)。小结:1.成功构建出能有效抑制ANXA11的AGS和SGC-7901胃癌细胞株。2.抑制ANXA11可明显抑制AGS和SGC-7901胃癌细胞增殖,导致细胞周期阻滞在G0/G1期3.抑制ANXA11后能够抑制AGS和SGC-7901胃癌细胞的迁移和侵袭能力,可能与下调MMP-2和MMP-9水平有关。4.抑制ANXA11后AGS和SGC-7901细胞内AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Cyclin D1和PCNA蛋白表达都不同程度有所降低,因此ANXA11调节细胞增殖可能部分通过AKT/GSK-3β/Cyclin D1信号通路来实现。第三部分抑制膜联蛋白A11对胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长影响的研究目的:研究抑制ANXA11在体内对裸鼠皮下移植瘤增殖的影响。方法:1构建能稳定抑制ANXA11的AGS和SGC-7901胃癌细胞株,进行裸鼠皮下移植瘤实验,并观察移植瘤的生长情况。2应用Western Blot和免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤组织ANXA11和Ki-67的表达情况。结果:1.经过荧光显微镜下筛选,在MOI分别为50和100的情况下AGS和SGC-7901细胞感染阳性率达到80%以上,后经RT-PCR和q PCR验证,与空载体转染组相比,ANXA11-si RNA转染组中AXNA11的表达水平明显降低,差异具有显著性(P0.05)。2.两组细胞于接种5天后均可形成肉眼可见的瘤体。生长曲线图显示ANXA11-si RNA转染组裸鼠皮下移植瘤较空载体转染组生长明显减慢,于3周时差异具有显著性。空载体组裸鼠移植瘤的平均瘤重为1.52士0.23g;ANXA11-si RNA转染组移植瘤的平均瘤重为0.66士0.19g,经统计学分析空载体转染组移植瘤的平均重量高ANXA11-si RNA转染组,差异具有统计学意义(P0.05)。3.Western Blot和免疫组化结果显示ANXA11-si RNA转染组裸鼠皮下移植瘤细胞中ANXA11和Ki-67的表达显著降低(P0.05)。小结:1.成功构建能稳定抑制ANXA11的AGS和SGC-7901胃癌细胞株。2.成功构建AGS细胞裸鼠皮下移植瘤模型。3.抑制ANXA11表达后可使裸鼠皮下移植瘤生长受到明显抑制,重量减轻。4.抑制ANXA11后移植瘤中ANXA11和Ki-67表达水平降低,说明胃癌细胞的增殖活性降低。结论1.ANXA11在胃癌组织中表达水平显著上调且与患者肿瘤大小、浸润程度、局部淋巴结转移、TNM分期及有无血管侵犯显著相关;在AGS和SGC-7901胃癌细胞株中ANXA11表达高于GES-1。2.抑制ANXA11能在体外显著抑制AGS和SGC-7901胃癌细胞的增殖、并导致细胞周期阻滞3.抑制ANXA11能在体外显著抑制AGS和SGC-7901胃癌细胞的迁移和侵袭能力,可能与下调MMP-2和MMP-9水平有关。4.ANXA11调控细胞增殖可能部分通过AKT/GSK-3β/Cyclin D1信号通路来实现5.抑制ANXA11后能显著抑制人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的增殖。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：
图 2 ANXA11 蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达Fig. 2 The expression ofANXA11 protein in gastric cancer tissues weredetected by western blot(A) and immunohistochemistry(B).(b,d: adjacent mucosa tissues; a,c: gastric carcinoma tissues)
A11 在不同胃癌细胞株和永生化的正常胃黏膜pression level ofANXA11 in gastric epithelial cenes by qPCR (A) and western blot (B). （compar*P<0.05）
51 2 不同浓度 ANXA11-siRNA1 转染后人胃癌细胞株 SGC-7901 和 A后细胞中 ANXA11 蛋白的表达ig. 2 Dose-dependent silencing ofANXA11 by SGC-7901 andAGS ceere treated with ANXA11-siRNA1 at the indicated concentrations of 1，80 nM，60 nM，40 nM, 20 nM or NC at the concentration of 40 nMithout treatment. (A, B): SGC-7901, (C, D):AGS *P<0.05 compared wNC group.
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