miR-33b调控Fli-1抑制肝癌发生发展的分子机制研究

发布时间：2020-08-01 09:44

【摘要】：研究背景和目的肝癌发病率位居我国消化道肿瘤之首,死亡率位于所有恶性肿瘤第三位。虽然近年来在临床手术切除、放化疗和靶向治疗等方面有了明显的提高,但远期生存率仍不理想。因此,探讨肝癌发生、发展的分子机制对开发新的治疗位点和提高治疗水平具有重要意义。肝癌的发生、发展过程是一个错综复杂的、受多个基因和多个细胞信号通路调控的过程。在众多调控因子中,microRNA(miRNA)成为近年来研究的热点。大量的研究报道证实miR-33b表达失衡与多种疾病密切相关,尤其是肿瘤的发生发展,然而有关miR-33b参与肝癌发病机制的报道较少,其在肝癌发生发展中的具体作用机制尚不明确。因此,本研究拟检测肝癌中miR-33b的表达水平,探讨其在肿瘤细胞中的生物学功能,试图为明确肝癌的发病机制及寻找新的治疗靶点提供科学依据。第一章肝癌组织和细胞系中miR-33b的表达水平分析目的观察miR-33b在肝癌组织和细胞系中的表达情况,为下一步探讨靶基因及进行功能研究奠定基础。方法收集50组肝癌及配对的癌旁组织标本,qRT-PCR法检测miR-33b表达;选取肝癌细胞株BEL7402,PLC/PRF/5,SMMC7721,MHCC97H和人正常肝细胞HL-7702,qRT-PCR法检测肿瘤细胞中miR-33b表达水平。结果与癌旁组织相比,大多数肝癌组织中miR-33b表达明显下调;和正常肝细胞 HL-7702 相比,肝癌细胞株 BEL7402,PLC/PRF/5,SMMC7721 和 MHCC97H中miR-33b亦表达降低。结论和正常对照组相比,miR-33b在肝癌组织和肝癌细胞中均表达下调。第二章 miR-33b靶基因Fli-1鉴定及Fli-1生物学行为探讨目的预测并验证miR-33b作用的靶基因;探讨Fli-1在肝癌中的生物学行为。方法通过生物信息学软件预测miR-33b的可能靶基因,克隆含有miR-33b和靶基因结合位点的序列至pmiRGLO载体上,分别构建pmiRGLO-Fli-l-3'UTR载体(wt)和pmiRGLO-Fli-l-3'UTR碱基突变载体(mut)。利用荧光素酶基因报告法、qRT-PCR及western blot等实验对靶基因进行验证;qRT-PCR及western blot法检测Fli-1在肝癌组织和肝癌细胞株中的表达,分析其与肝癌患者的临床病理相关性;通过克隆平板实验、划痕实验及Transwell实验检测Fli-1对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果生物信息学预测Fli-1为miR-33b潜在的靶基因;双荧光素酶基因报告实验结果显示:和阴性对照(NC)组对比,pmirGLO-Fli-13'UTR(wt)和miR-33b mimic共转染后能有效抑制荧光素酶活性,而对结合位点进行碱基突变后,荧光素酶活性和对照组相比无明显改变;qRT-PCR结果显示,与NC组Fli-1 mRNA表达量相比,转染miR-33b mimic组无明显变化;western blot结果发现,miR-33b mimic转染组Fli-1蛋白表达明显下调;Fli-1在肝癌组织和肝癌细胞株中表达上调,并和远处转移密切相关;和NC组相比,Fli-1过表达组肝癌细胞的克隆形成能力显著增加,迁徙及侵袭能力明显增强;Fli-1敲减组,肝癌细胞的克隆形成能力变弱,迁徙及侵袭能力亦出现下调。结论Fli-1为miR-33b的直接靶基因,Fli-1在肝癌中发挥癌基因功能。第三章miR-33b在肝癌中的生物学功能及分子机制研究目的检测miR-33b对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;探讨miR-33b在肝癌中发挥生物学效应的分子机制。方法在细胞中转染miR-33b mimic和pcDNA3.1-Fli-1分别上调肝癌细胞中miR-33b和Fli-1表达;应用CCK-8法检测miR-33b对肝癌细胞增殖的影响;克隆平板形成实验检测miR-33b对肝癌细胞克隆形成能力的影响;划痕实验检测miR-33b对肝癌细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测miR-33b对肝癌细胞侵袭能力的影响;western blot法检测MMP2的表达变化。结果在肝癌细胞株中过表达miR-33b后,肝癌细胞增殖和克隆形成能力明显下调;划痕实验显示和NC组相比,肝癌细胞迁移距离变短,速度变慢;Transwell实验显示穿过Matrigel的细胞数目明显减少;Western blot结果显示MMP2表达下调。肝癌细胞中同时上调miR-33b和Fli-1表达组,和单独上调miR-33b组相比,肝癌细胞增殖和克隆形成能力显著增加;肝癌细胞迁移速度变快;侵袭能力亦明显增加;MMP2表达显著增多。结论miR-33b通过靶向下调Fli-1,进而抑制MMP2,降低肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其在肝癌发生发展过程中发挥抑癌基因的功能。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

序列,前体,序列,癌细胞系

１６－邋ｇｕｇｃａｉｍｇｃｕｇｉｍｇｃａｕｕｇｃ邋－３５逡逑图１－２人ｍｉＲ－３３ｂ成熟序列逡逑２．逦ＲＮＡ浓度和纯度测定逡逑肝癌临床组织样本和肝癌细胞系分别提取ＲＮＡ，进行１．０％的琼脂糖凝胶逡逑

电泳图,电泳图,肝癌

我们首先在５０对肝癌临床组织标本和配对的癌旁组织中分析了邋ｍｉＲ－３３ｂ逡逑表达水平。焚光定量ＰＣＲ结果显示：相对于癌旁组织，有３８例（３８／５０）肝癌逡逑组织中的ｍｉＲ－３３ｂ水平有不同程度的下降（图１－５），差异有统计学意义逡逑（Ｐ＜０．０１），１２例（１２／５０）肝癌标本中的ｍｉＲ－３３ｂ表达上调。逡逑为了进一步明确ｍｉＲ－３３ｂ与肝癌发生发展的相关性，随后我们又在肝癌细逡逑胞系中检测了邋ｍｉＲ－３３ｂ的表达情况。ｑＲＴ－ＰＣＲ结果显示相对于人正常肝脏细胞逡逑ＨＬ－７７０２，肝癌细胞系邋ＢＥＬ７４０２，邋ＰＬＣ／ＰＲＦ／５，邋ＳＭＭＣ７７２１，ＭＨＣＣ９７Ｈ邋中邋ｍｉＲ－３３ｂ逡逑１９逡逑

熔解曲线,抑癌基因,肝癌组织,肝癌

第一章肝癌组织和细胞系中ｍｉＲ－３３ｂ的表达水平分析平均出现不同程度的下调（图１－６）。上述结果提示ｍｉＲ－３３ｂ与肝癌切相关，在肝癌发病机制中可能发挥抑癌基因作用。逡逑

【参考文献】