雄激素受体细胞质膜转移机制及其功能的研究

发布时间：2020-08-01 10:32

【摘要】：雄激素受体(Androgen receptor,AR)是I型核受体家族成员,在男性性特征发育及表型维持中发挥着重要的作用。在雄激素的不存在的情况下,雄激素受体处于非激活状态与热启动蛋白相互作用定位于细胞质中,在雄激素的作用下,雄激素受体发生构象改变,形成二聚体进而转入细胞核中,激活靶基因的表达,诱导细胞增殖,分化等生理活动,这样的通路被认为是雄激素受体经典通路,也称为基因组雄激素受体通路。越来越多的研究发现雄激素受体可以在几分钟内快速的应答雄激素受体,而这种快速的应答不依赖于雄激素受体的细胞核转移,不依赖于靶基因的表达,因而把这样一种雄激素受体通路称为非基因组雄激素受体通路。通过非基因组雄激素受体通路,雄激素受体可以激活PI3K-AKT,ERK,Src等信号传导通路等。近来随着对雄激素受体非基因组功能研究的深入,科研人员发现AR除了发生细胞核转移,同时AR也可在雄激素的作用下发生快速的细胞质膜转移,而这种AR的细胞质膜转移与PI3K-AKT的激活相关,干扰AR的细胞质膜转移,抑制AKT的磷酸化与激活,暗示AR的细胞质膜转移可能对AR的功能有着重要意义。有研究认为AR的细胞质膜转移与caveolin-1蛋白相关,过表达caveolin-1可检测到更多的AR转移至细胞质膜,但多数前列腺癌细胞系中,AR与caveolin-1并不存在共表达,暗示表达caveolin-1可能参与协助AR的细胞质膜转移,但该转移并不依赖于caveolin-1。目前对于AR具体是通过何种方式转移至细胞质膜并不是很清楚。相反AR的细胞核转运的机制研究较为明确,AR与动力蛋白dynein结合通过微管依赖的模式转移至近核端,随后依赖于Importinα/β介导的通路完成入核过程。那么AR的细胞质膜转移过程又是如何呢,是否也依赖于微管呢?是否也需要马达蛋白相互作用进而通过微管转运呢?同时AR转移至细胞质膜后,除了激活PI3K-AKT通路还参加哪些细胞生理过程呢?针对以上未知问题,本论文首先通过免疫荧光和细胞质膜组分分离手段,证明了在雄激素的作用下,AR可以发生快速的细胞质膜转移,通过雄激素受体拮抗剂可有效的抑制AR的细胞质膜转移,进一步说明中AR的细胞质膜转移由雄激素诱导。通过蔗糖密度梯度离心的方式,我们对AR的细胞质膜定位进行了定量分析,发现雄激素作用20分钟的条件下,8%左右的AR转移至细胞质膜,充分证明了在雄激素作用下AR可发生快速的细胞质膜转移。进一步,本论文发现使用微管靶向药物多西紫杉醇(抑制微管解聚)或诺考达唑(抑制微管稳定)均可抑制AR的细胞质膜转移,而通过细胞松弛素D干扰微丝的功能对AR的细胞质膜转移没有作用,证明了AR的细胞质膜转移依赖于微管但并不依赖于微丝。进一步探究本论文发现KIF5B作为驱动蛋白介导了AR依赖于微管的运输,通过dominant-negative mutant或者siRNA敲除KIF5B,均抑制了AR的细胞质膜转移。同时干扰KIF5B的功能也抑制了下游AKT的激活,证明了KIF5B参与AR的细胞质膜运输。如果KIF5B是以驱动蛋白的形式参与AR运输,那么AR与KIF5B之间一定存在相互作用,通过免疫沉淀实验,发现AR与KIF5B存在相互作用,同时雄激素可以诱导AR与KIF5B之间作用加强。通过构建不同AR功能结构域的缺失,进一步发现AR是通过N端结构域参与与KIF5B的相互作用,基于以上实验,充分说明了驱动蛋白KIF5B介导了AR的细胞质膜转移。棕榈酰化修饰对于蛋白质的细胞质膜定位有重要意义,固醇类核受体家族成员均可发生棕榈酰化修饰,AR的棕榈酰化修饰发生在第807位半胱氨酸,通过使用2-bromopalmitate特异性抑制AR的棕榈酰化修饰或者突变其棕榈酰化位点(AR-C807A)可有效的抑制AR的细胞质膜定位,但不能影响AR与KIF5B的结合,暗示棕榈酰化修饰可能参加AR的细胞质膜锚定,但并不参与AR向细胞质膜运输的过程。进一步对细胞质膜定位的AR的进行功能研究,发现干扰AR细胞质膜转移抑制了AR对靶基因的调控,减弱了雄激素作用下AR对PSA和TMRPSS2的mRNA的诱导作用,通过免疫荧光技术发现AR-C807A(细胞质膜转移缺失AR)不仅不能定位于细胞质膜,在雄激素作用下其细胞核转移速率也受到了抑制,应用细胞核质蛋白分离手段,进一步确认了在雄激素作用下AR-C807A具有较慢的入核速率。以上实验说明了8%发生细胞质膜转移的AR可以调控其余AR的入核过程,调节其转录活性,调节其基因组功能。野生型的AR在雄激素的作用下可以快速诱导HSP27的磷酸化,磷酸化的HSP27随后可与AR结合,协助AR的快速入核,本论文发现AR-C807A在雄激素的作用下不能诱导HSP27的磷酸化,暗示细胞质膜转移AR可能通过磷酸化HSP27,进而调节AR的细胞核转移。进一步确认HSP27的作用,本论文在将HSP27-mimic(磷酸化HSP27)和AR-C807A共表达,发现HSP27-mimic可以恢复AR靶基因TMRPSS2的表达,同时可以恢复部分由AR-C807A抑制的细胞增殖,充分证明了细胞质膜转移AR通过激活HSP27调节AR的基因组功能,调节细胞增殖,靶基因的表达。总结以上实验,本论文对AR细胞质膜机制及其作用进行了深入研究,发现了AR通过微管依赖的方式发生细胞质膜转移,驱动蛋白KIF5B通过与ARN端结构域结合介导了这一转运过程,发生细胞质膜转移的AR可以调节AKT的激活,磷酸化HSP27,进而调控AR的细胞核转移及其转录活性。以上研究为完善雄激素信号传统通路提供了重要的实验数据。同时AR的细胞质膜转移可以发生在极低的雄激素浓度下(去势抵抗治疗条件下)也暗示AR的细胞质膜转移可能在去势抵抗前列腺癌中发挥着重要作用,为去势抵抗前列腺癌的治疗也提供了新的分子机制。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25
【图文】：

雄激素受体

受体（mineralocorticoid receptor，MR）22 24。雄激素受体主要表达应答雄激素的组织中，比如前列腺，骨骼肌，肝脏和中央神经系统25。雄激素受体可以被内源的雄激素激活，包括睾酮（ Testosterone ）和 5α- 双氢睾酮（ 5α-hihydrotestosterone，DHT）。雄激素受体参与众多生理过程，包括促进青春期发育，参与前列腺发育与功能26 28。1.2.1 雄激素受体结构雄激素受体基因由 X 染色体长臂 q11-12 编码，其 mRNA 约为 10.6kb，包括 8个不同的外显子29 31。雄激素受体蛋白由 920个氨基酸组成，分子量为 110KDa，分成 4 个不同的功能结构域，包括 N 端结构域（N-terminal domain，NTD ）， DNA 结合结构域（ DNA binding domain ，DBD），Hinge 结构域（Hinge domain）以及 C 端配体结构域（Ligand binding domain，LBD）22,28。每个结构域对于雄激素受体的功能完整性都具有重要意义。

序列,雄激素受体

图 1.2 雄激素受体可变剪切Figure 1.2 Androgen receptor splice variantsEndocr. Relat. Cancer.; 23 （2016）在这 20 多种 ARVs 中，ARV7 的表达率最高，有文献对去势抵抗前列腺癌患者的血样中循环肿瘤细胞的 DNA 进行提取，发现在大于 50%的样本中检测到 ARV786。ARV7 的 mRNA 包括 AR 经典的前三个外显子，和一个 V7 特异性的外显子 CE3，CE3 表达一个 16 氨基酸的序列，该序列为 ARV7 特有的，CE3的剪切造成外显子 4-8 无法正确剪切，因而 ARV7 缺失 C 端配体结合结构域。ARV7 因缺少 C 端配体结构域，并不能与雄激素结合，同时因其具有部分入核序列，而缺少出核序列，ARV7 无论在配体存在下或者配体缺失情况下均定位于细胞核中，同时具有持续活性。ARV7 的表达与紫杉醇类药物抵抗相关，紫杉醇类药物可干扰微管的结合，进而干扰 AR 的细胞核转移过程，而研究发现

雄激素受体,传导通路,经典

图 1.3 经典雄激素受体传导通路Figure 1.3 Classical androgen receptor signaling pathwayNature Reviews Cancer, 1, 34-45, （2001）激素受体功能相关转录调节蛋白的雄激素受体通路中，AR 的功能及活性可通过与不同的被调控。在激活状态下即 AR 与激动剂结合状态下，A加其转录活性，包括甾类激素受体共调节因子（steroidSRC）, CREB 结合蛋白（CREB binding proteins ，CBP结合因子（p/CAF）等，进而协助高效转录105。表 1.4 为ctivator 及其功能。在抑制状态下，即 AR 与拮抗剂结合状repressor，包括 SMRT (silencing mediators of retinoic acid

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