肺癌血液单个循环肿瘤细胞检测及其EGFR突变分析

发布时间：2020-08-01 14:32

【摘要】：研究背景:肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。近二十年来,分子靶向药物的应用逐渐增多,己经成为具有表皮生长因子受体(EGFR)敏感基因突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗选择。EGFR是NSCLC常见的癌症驱动基因,EGFR敏感基因突变阳性是应用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向药物的前提。虽然EGFR基因敏感突变的晚期肺癌患者接受EGFR-TKIs治疗的有效率可达到60%-80%,但大多数患者最终都会不可避免地出现T790M、C797S等EGFR耐药基因突变,目前EGFR检测主要依靠组织活检标本,液体活检对肺癌靶向治疗的指导作用,越来越受到关注。液体活检主要包括循环肿瘤脱氧核糖核酸(ctDNA)和循环肿瘤细胞(CTCs)的检测。CTCs是由原发或转移病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞,其作为一种实时“液体活检”的材料反映了肿瘤是否发生侵袭转移,CTCs在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的诊断初期均能检测到,是疾病不良预后的独立预测因素。利用ctDNA进行EGFR突变分析的技术正在逐步进入临床,CTCs也具有即时性、可富集性,且携带较ctDNA更为完整的肿瘤分子生物学信息,具有潜在更高的分子生物学检测敏感性。为此临床上基于CTCs的EGFR突变检测及潜在的异质性分析,具有重要耐药机理和临床靶向治疗的研究价值。研究目的:本研究的目的是通过建立CTCs检测、分离的技术平台,检测并分离临床肺癌患者外周血CTCs,进行DNA提取扩增、EGFR突变的分析,并探索外周血CTCs的异质性。研究方法:单个循环肿瘤细胞分离技术的建立。本研究将肺癌细胞系掺入全血,去除红细胞,运用全自动磁性细胞分选仪分选掺入的细胞,阳性组分进行细胞固定,上皮标识免疫荧光抗体进行细胞染色,CellEctor进行计数及分离细胞。临床肺癌患者循环肿瘤细胞的临床检测。共入组121例肺癌患者、20例肺部良性疾病患者和20例健康志愿者(对照组),收集外周血标本(4.5 mL)。通过用抗细胞角蛋白/抗EpCAM/抗CD45抗体和hoechst染色进行免疫细胞化学检测,利用CellEctor进行CTCs计数,并捕获分离单个CTC。肺癌患者循环肿瘤细胞的EGFR突变分析。分离CTCs后进行核酸提取、扩增。使用扩增阻滞突变系统(ARMS)和数字聚合酶链式反应(dPCR)等技术分析EGFR基因突变,及CTCs信息分析。研究结果:在肺癌细胞系掺入外周血的回收实验中,选择NCI-H2009作为掺入首选细胞,裂解红细胞,CD326磁珠阳性分选细胞,运用丙酮进行细胞固定,双上皮标识的免疫荧光抗体进行细胞染色,CellEctor进行细胞计数、挑选分离。掺入细胞数分为2、5、10、20、40、100共5个梯度,掺入实验前后共重复4次。掺入2个细胞的时候,回收率在50%-100%(平均62.5%);掺入10个细胞的时候,回收率在60%-80%(平均67.5%);掺入100个细胞的时候,回收率趋于稳定在83%-89%(平均84%),掺入实验的总体回收率在62.5%-84%之间。确诊为肺癌的109例患者,其整体检出率57/109(54.8%)。TNM分期IIIIV期肺癌患者CTC总体捕获率为61.5%(56/91),而在健康志愿者中未检测到CTC。III期和IV期患者的CTC阳性检出率分别为25.0%(4/16)和69.3%(52/75),结果具有统计学意义(Mann-Whitney检验,P=0.0081)。小细胞肺癌患者的CTC检出数量(平均8.22)明显高于其他病理类型的患者,肿瘤长径与CTCs计数结果不具有统计学意义。在EGFR突变阳性的患者中,单个CTC水平EGFR突变检出率较低(16.67%,2/12)。灵敏度随着CTC数量的增加而增加。4例患者在10个细胞水平显示与组织突变一致的EGFR突变,1例患者在CTC之间显示明显不一致和罕见的突变(G719X)。结论:建立了用于从血液中分离CTC的简化技术,多个CTCs分析可提高EGFR突变检测敏感性;CTC和组织标本中EGFR突变的检测通常表现出同质性,而CTC水平突变分析可能有助于发现异质性突变,具有深入研究价值。
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

细胞,荧光抗体

3.5.2 200g 离心 5min，用 PBS 重悬细胞，重复洗涤细胞 2 次。3.5.3 0.2％的 Triton X-100 作用 2min，目的是给固定后的细胞膜打孔，以便免疫荧光染色（丙酮固定可省略此步骤）。3.5.4 200g 离心 5min，用 PBS 重悬细胞，洗涤细胞 2 次。3.5.5 加 1%BSA/10%山羊血清/0.3M 甘氨酸，孵育 1h，防止非特异性的蛋白结合。3.5.6 根据荧光抗体说明书，每份样品加 CK8 荧光抗体 2ul，CK18 抗体1ul，CK19 荧光抗体 2ul，CD326（EpCAM）荧光抗体 5ul，CD45 荧光抗体5ul，4℃孵育 30min。3.5.7 加三倍体积的 DAPI 或 Hoechst 溶液， 4℃孵育 5min。3.5.8 加 PBS 5mL，200g 离心 5min，重复洗两遍，重选细胞悬液体积至 50-100ul。3.6 循环肿瘤细胞的单细胞挑选

流程设计,均质性,流式细胞仪分析,分离效率

25图 2 CTCs 分离实验流程设计掺入肺癌细胞系选择与分离效率评估我们选择了多种肺癌细胞系：A549、HCC827、NCI-H1975、NCI-H2009，pCAM 的表达，表达强弱依次是 NCI-H2009 >HCC827>NCI-H1975>A549是 H2009 流式细胞仪分析的结果，H2009 显示良好的 EpCAM 表达均质性

散点图,散点图,细胞的,目的

图 3 A 图为 NCI-H2009 细胞的散点图，我们圈选红色的部分作为分析的目的细胞群。B图左边蓝色峰为未标记 EpCAM 荧光抗体的 NCI-H2009 细胞系，右边绿色峰为标志EpCAM 荧光抗体的 NCI-H2009 细胞3、 CTCs 染色方法的优化本研究涉及到 CTCs 的检测和后续的肿瘤分子生物学分析，本研究首先优化了配套 CTCs 染色的关联试剂，包括 CTCs 富集后 EpCAM 复染、CKs 染色、核染色及 CD45 染色。本研究对主要的抗体进行先期染色特异性分析。关于 EpCAM荧光抗体，我们挑选了四种，其中 GSC 抗体为本实验室自制抗，委托 GSC 公司添加荧光二抗，BD、SB、ABI 均采购自公司，整体上几种抗体都不影响染色阳性结果的判断，但 BD 公司的抗体 CF594 Mouse Anti-Human CD326（PE）染

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