口腔鳞状细胞癌生物学行为与自噬、凋亡相关性研究

发布时间：2020-08-07 12:29

【摘要】：研究目的:通过研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)与化疗药物顺铂(cisplatin,DDP)联合应用对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡情况的影响,结合ABT-263抑制Bcl-2前后口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞中自噬相关蛋白Beclin1、P62与抗凋亡蛋白Bcl-2的表达变化,以期初步探讨CAL-27细胞生物学行为及自噬与凋亡的可能关联。采用免疫组织化学方法研究53例口腔鳞状细胞癌石蜡标本中自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达,分析自噬在口腔鳞状细胞癌中的表达情况及其与临床病理特征间的关系,旨在为口腔鳞状细胞癌的治疗提供新的方向。研究方法:1.应用CCK-8增殖实验检测不同浓度、不同时间下,3-MA、DDP作用于口腔鳞状细胞癌CAL-27后细胞生长情况,筛选实验所需3-MA药物浓度,计算DDP半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC_(50))作为实验浓度,检测空白对照组、3-MA组、DDP组、3-MA+DDP组作用细胞24 h后细胞抑制率;2.应用Transwell实验分别检测空白对照组、3-MA组、DDP组、3-MA+DDP组作用细胞24 h后迁移侵袭细胞数及其迁移侵袭指数;3.应用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测空白对照组、3-MA组、DDP组、3-MA+DDP组作用细胞24 h后细胞凋亡情况;4.Western blotting法检测应用3-MA、ABT-263前后细胞中自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达情况;5.应用免疫组织化学方法检测53例口腔鳞状细胞癌石蜡标本中LC3、Beclin1的表达情况。研究结果:1.CCK-8检测结果示:3-MA、DDP分别单纯作用于CAL-27细胞24 h、48 h及72 h后,细胞生长受到抑制,抑制率随时间延长及药物浓度的增加而增加,即具有时间及药物浓度依赖性。空白对照组与3-MA组细胞活力无明显差别,DDP组及3-MA+DDP组细胞生长受到抑制,且3-MA+DDP组(OD值=0.445±0.029)细胞增殖活力明显小于DDP组(OD值=0.657±0.038,P=0.000);2.采取Transwell迁移实验比较空白对照组、3-MA组、DDP组、3-MA+DDP组小室下表面迁移细胞数:药物作用24 h后,与空白对照组(127.25±4.03个)相比,3-MA组(119.75±5.12个)的迁移细胞数无明显减少,DDP组(77.5±6.19个)、3-MA+DDP组(51.75±7.68个)迁移细胞数显著减少,且3-MA+DDP组迁移细胞数较DDP组更少,差异有统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,3-MA组、DDP组、3-MA+DDP组的迁移指数分别为94.11%、60.90%、40.67%;采取Transwell侵袭实验比较四组穿透Matrigel后小室下表面细胞数:药物作用24 h后,与空白对照组(183.25±4.11个)比,3-MA组(178.25±2.22个)的小室下表面细胞数无明显减少,DDP组(84.25±6.40个)、3-MA+DDP组(51.50±4.20个)小室下表面细胞数显著减少,且3-MA+DDP组小室下表面细胞数较DDP组更少,差异有统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,3-MA组、DDP组、3-MA+DDP组的侵袭指数分别为97.27%、45.98%、28.10%;3.流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测四组细胞的凋亡情况:空白对照组及3-MA组细胞无明显凋亡,DDP组较空白对照组、3-MA组细胞凋亡率明显增加(凋亡率为31.1%),3-MA+DDP联合用药组细胞凋亡率较DDP组显著增加,可达57.6%;4.Western blotting法检测结果示:空白对照组自噬相关蛋白处于基础水平,应用3-MA抑制剂后,自噬相关蛋白LC3表达下降。应用Bcl-2抑制剂ABT-263后,P62表达无明显变化,Beclin1表达降低;5.免疫组织化学结果显示:LC3、Beclin1主要表达于细胞浆,LC3在口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率(73.58%)显著高于癌旁组织中的表达(7.14%,P0.05);Beclin1在口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率(43.40%)显著高于癌旁组织中的表达(7.14%,P0.05)。分析显示:LC3、Beclin1的表达与口腔鳞状细胞癌患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史均无明显相关性(P(29)0.05);与口腔鳞状细胞癌分化程度、淋巴结转移相关(P0.05),肿瘤分化程度越低,LC3、Beclin1的阳性表达率越低。相比未发生淋巴结转移者,有淋巴结转移的标本中,LC3、Beclin1的阳性表达率降低,差异具有统计学意义(P0.05)。研究结论:1.DDP可诱导口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞发生保护性自噬;3-MA可抑制细胞自噬水平,这种抑制具有时间、药物浓度依赖性;2.单纯应用实验所选3-MA作用细胞24 h对细胞增殖无明显抑制作用。3-MA联合DDP作用细胞24 h可降低DDP的IC_(50)值,即3-MA可增强CAL-27细胞对DDP的敏感性,但仍需动物模型实验及临床相关试验进一步研究;3.LC3、Beclin1蛋白在口腔鳞状细胞癌中高表达,且表达水平与患者的肿瘤分化程度及淋巴结转移有关;4.Beclin1自噬信号通路与Bcl-2介导的细胞凋亡相关,可作为研究治疗口腔鳞状细胞癌的新方向。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.8
【图文】：

细胞,口腔鳞状细胞癌,甲基腺嘌呤

天津医科大学硕士学位论文一、 3-甲基腺嘌呤抑制口腔鳞状细胞癌自噬对其增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响（2）将 Matrigel 胶与无血清 DMEM 培养基按 1∶5 稀释，取 45 μl 均匀铺到Transwell 上室内,将小室放入 24 孔板中，37 ℃恒温孵育 4 h 待其凝固成胶状；（3）余步骤同 1.1.4.9。1.1.5 统计学分析使用SPSS Statistics 17.0软件进行实验数据处理和统计学分析，实验组数据OD值及细胞数以 x±s 表示，采用多个独立样本的方差分析进行统计，以 P<0.05 为差异具有统计学意义。1.2 结果1.2.1 口腔鳞状细胞癌 CAL-27 细胞培养倒置相差显微镜下观察，细胞大小均匀，结构清晰，连接紧密，细胞浆丰富，形态呈铺路石状，具有上皮样细胞的特征。

细胞,口腔鳞状细胞癌,甲基腺嘌呤

【参考文献】