Nrf2-Keap1信号通路与多柔比星对白血病细胞K562作用的研究

发布时间：2020-08-07 20:12

【摘要】：背景:化疗在癌症综合治疗中占有重要地位。然而,化疗药物的毒副反应和耐药问题严重影响治疗效果。特别是多药耐药(multidrug resistance,MDR)使得联合化疗疗效逐渐降低,导致治疗失败。多柔比星(Doxorubicin,DOX)是目前临床化疗中最广泛使用的蒽环类药物(Anthracyclines,ANTs)之一。蒽环类药物是周期非特异性抗生素,对处于各生长周期的癌症细胞均有杀灭作用。作为临床最有效的广谱抗癌药物,蒽环类药物应用中同样存在毒副反应和耐药两个问题。蒽环类药物通过代谢产生活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS),提高癌细胞内氧化水平,诱导细胞凋亡;大量活性氧簇也可引起癌细胞坏死,产生抗癌作用。另一方面氧化水平提高也诱导癌细胞内氧化应激防御通路活化,药物代谢酶表达增加,导致毒副反应增加,诱导耐药。氧化应激机制在蒽环类药物作用及诱导耐药中研究日益受到重视。核因子E2相关因子2/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1信号通路(nuclear factor E2-related factor 2/Kelch-like ECH-associated protein 1,Nrf2-Keap1)是细胞内最重要的抗氧化应激调控通路。氧化应激可激活该通路,致使Nrf2与抑制蛋白Keapl解偶联并在多种蛋白激酶的磷酸化作用下转移入细胞核,与抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)相结合,启动下游一系列抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的转录,发挥强大的抗氧化作用,恢复细胞内氧化-抗氧化平衡。激活Nrf2-Keap1信号通路可激活下游抗氧化酶类的转录表达,产生抗氧化应激作用;上调药物代谢酶基因转录表达促进药物代谢;还可调控其它信号通路(如细胞自噬、抗凋亡通路),产生副反应,并诱导耐药的产生,从而降低化疗药物疗效。抑制Nrf2-Keap1信号通路已成为逆转癌细胞耐药的重要靶点之一。采用Nrf2-Keap1信号通路抑制剂与抗癌药联用,增强癌细胞对化疗药的敏感性,改善化疗药物的治疗效果,为癌症治疗提供新途径。第一部分Nrf2-Keap1信号通路与多柔比星对白血病细胞K562作用的相关性目的:通过检测DOX作用下K562细胞中Nrf2-Keap1信号通路、自噬相关蛋白及基因信使RNA(Message RNA,m RNA)表达情况;检测DOX联合放线菌酮作用下K562细胞中Nrf2蛋白的表达情况,探讨Nrf2-Keap1信号通路与DOX对K562细胞作用的相关性。方法:1、CCK-8比色法检测不同浓度的DOX对K562细胞的增殖影响,计算50%抑制浓度(IC50),确定DOX的实验浓度。2、Western blot方法检测不同浓度的DOX作用于K562细胞4h及16h后,Nrf2-Keap1信号通路蛋白表达(Nrf2、Keap1、GCS、AKR1C1、CBR1)及自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62)表达水平。3、实时荧光定量PCR技术检测不同浓度的DOX作用于K562细胞4h及16h后,Nrf2-Keap1信号通路基因(Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1)及自噬相关基因(Beclin-1、LC3、P62)的m RNA水平相对表达量。4、Western blot方法检测DOX联合放线菌酮作用于K562细胞后,Nrf2蛋白的半寿期。结果:1、不同浓度的DOX作用于K562细胞48h时,K562细胞活性呈现浓度依赖性。小剂量DOX对K562细胞生长有刺激作用,大剂量DOX对K562细胞有明显抑制生长的作用。IC50:1.13μg/ml。2、不同浓度的DOX作用于K562细胞4h时,Nrf2-Keap1信号通路蛋白Nrf2和AKR1C1表达上调。Keap1、GCS蛋白表达无明显变化。自噬通路蛋白Beclin-1,LC3表达上调,P62表达无明显变化。3、不同浓度的DOX作用于K562细胞16h时,Nrf2-Keap1信号通路蛋白Nrf2、GCS、CBR1表达上调。Keap1、AKR1C1表达无明显变化。自噬通路蛋白Beclin-1,LC3表达上调,P62表达降低。4、不同浓度的DOX作用于K562细胞4h时,实验组Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1基因m RNA表达量无明显变化。Beclin-1基因m RNA表达量明显上调,而LC3、P62基因m RNA表达量无明显变化。5、不同浓度的DOX作用于K562细胞16h时,实验组Nrf2基因m RNA表达量与阴性对照组的差异无统计学意义。GCLM、AKR1C1、CBR1基因m RNA表达量上调。Beclin-1基因m RNA表达量轻度上调,LC3、P62基因m RNA表达量有所下调。6、DOX作用时,采用放线菌酮抑制蛋白合成条件下,Nrf2蛋白的半寿期轻度延长。结论:DOX可以提高Nrf2蛋白累积量,激活Nrf2-Keap1信号通路,促进下游靶基因GCLM、AKR1C1、CBR1转录表达,蛋白水平升高。DOX可以激活细胞自噬。DOX通过提高细胞自噬水平,也可以增加Nrf2蛋白累积量,进而激活Nrf2-Keap1信号通路。第二部分鸦胆子苦醇抑制Nrf2-Keap1信号通路与多柔比星作用的研究目的:探讨鸦胆子苦醇(Brusatol)抑制Nrf2-Keap1信号通路对DOX作用于K562细胞的影响;并初步探讨鸦胆子苦醇提高DOX抑制K562细胞增殖的作用机制。为鸦胆子苦醇的临床应用提供的实验依据。方法:1、Western blot方法检测不同浓度鸦胆子苦醇作用16h后,K562细胞中Nrf2-Keap1信号通路蛋白(Nrf2、Keap1、AKR1C1)表达,选择合适的实验浓度。2、Western blot方法检测100n M鸦胆子苦醇联合不同浓度的DOX处理K562细胞后,Nrf2-Keap1信号通路蛋白(Nrf2、CBR1)表达及凋亡相关因子蛋白(cleaved-caspase 3/caspase 3)表达。3、CCK-8比色法检测100n M鸦胆子苦醇联合不同浓度的DOX作用48h后,K562细胞活性。结果:1、鸦胆子苦醇可抑制Nrf2蛋白及其下游AKR1C1蛋白表达;对Keap1蛋白表达无明显影响;100n M是合适剂量。2、在DOX作用时,联合鸦胆子苦醇可降低Nrf2和CBR1蛋白表达,提高cleaved-caspase 3/caspase 3蛋白表达。3、鸦胆子苦醇可增强DOX诱导K562细胞凋亡作用。结论:鸦胆子苦醇可抑制DOX诱导的K562细胞中Nrf2蛋白累积,抑制Nrf2-Keap1信号通路及下游靶蛋白表达,进而降低K562细胞抗氧化应激能力。联合鸦胆子苦醇处理K562细胞,可增强DOX诱导K562细胞凋亡作用。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.7
【图文】：

分析法(ANOVA)，P 值小于 0.05 有统计学意义。结 果1、DOX 对白血病细胞 K562 生长的影响本实验以白血病细胞 K562 为实验对象。参考我们前期实验结果，以 2 置 DOX 浓度梯度。CCK-8 比色法验证了 48h 时间点，不同浓度 DOX 对 K的细胞毒作用(见图 1)。结果显示不同浓度 DOX (浓度范围：0、0.019、0.0390.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml)作用 48h 对 K562 细胞作小剂量 DOX 对 K562 细胞生长有刺激作用。大剂量 DOX 对 K562 细胞有明长的作用，且药物剂量越大抑制作用越强，在一定范围内呈剂量依赖关系，1.13μg/ml。选择 1μg/ml 为后续实验浓度，此浓度既能导致氧化应激效应，又细胞不至于死亡过多。

图 3（右） DOX（0，0.25, 0.5，1μg/ml）作用于 K562 细胞 163、Nrf2-Keap1 信号通路基因（Nrf2、GCLM、AKR1C1、相关基因(Beclin-1、LC3、P62）的 mRNA 水平相对表达量。Real-time quantitative PCR 技术检测不同浓度的 DOX（0.5，细胞 4h 后，实验组 Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1 基因 mRNA与阴性对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）。Beclin-1 基因 m调，而 LC3，P62 基因 mRNA 表达量无明显变化。（见图 4-10）Real-time quantitative PCR 技术检测不同浓度的 DOX（0.5, 1细胞 16h 后，实验组 Nrf2 基因 mRNA 表达量与阴性对照组的差＞0.05）。GCLM、AKR1C1、CBR1 基因 mRNA 表达量上调。表达量轻度上调，LC3、P62 基因 mRNA 表达量有所下调。（见结果显示 DOX 作用后，Nrf2 基因 mRNA 表达量无明显变

号通路与多柔比星对白血病细胞 K562 作用的相关性 因转录水平机制激活 Nrf2-Keap1 信号通路。DOX 作用后，因转录水平机制提高细胞自噬水平。

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本文编号：2784467