白介素9在肝癌及其所致恶性腹腔积液中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-08 03:01

【摘要】：全国肿瘤登记中心通过分析全国肿瘤发病与死亡资料,估计2015年全国肝癌相关死亡率在恶性肿瘤相关的死亡率中排名第3位,发病率在恶性肿瘤中位于第4位。尽管近年来医学研究、医疗设备和医疗技术取得了很大的进步,但目前临床上缺乏治疗肝癌的有效方法。多数肝癌患者晚期会出现大量恶性腹腔积液(malignant ascites,MA),大量腹腔积液严重影响患者的生存质量?目前没有治疗恶性腹腔积液十分有效的方案。目前的研究认为血管渗透性增加和新生血管的形成是MA形成的主要机制。研究者认为拮抗血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶的作用可以减少MA的形成?但这些药物的临床疗效有限,仍需寻找其他有效的治疗手段。肝癌的发生、发展过程中多条信号通路起着重要的作用。目前的研究认为在肝癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤组织和细胞中信号转导与转录激活因子家族(signal transduction and activators of transcription,STATs)的重要成员STAT3异常表达和激活,STAT3参与了肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡过程。免疫细胞及免疫因子参与了肝癌发生、发展的各个环节。白介素(IL)-9是Th9、Th17等多种免疫细胞分泌的免疫效应因子。IL-9通过与IL-9受体结合发挥生物学作用。目前的研究发现IL-9具有多种免疫效用,它即存在促炎作用又存在抗炎作用。但目前IL-9在肿瘤中的研究较少,IL-9与肿瘤的关系尚未明确。研究发现使用IL-9干预黑色素瘤细胞,可抑制细胞的生长。相反的是,在肺癌的研究发现IL-9能促进肺癌细胞的增殖。我们在前期的研究中发肝癌并恶性腹腔积液患者MA中Th9细胞比例以及IL-9浓度高于对应外周血水平,也高于肝硬化患者腹水中的水平。且相关性分析发现MA中Th9细胞比例以及IL-9水平与患者的生存时间呈负相关关系。那么Th9/IL-9对肝癌细胞的生物学行为存在怎样的影响呢?Th9/IL-9是通过何种机制对肝癌细胞产生影响的呢?Th9/IL-9是否可以作为肝癌恶性腹腔积液干预治疗的靶点呢?为探索上述问题我们将从以下两方面进行研究:第一部分白介素-9对肝癌细胞的生物学作用及其机制研究目的:研究白介素(IL)-9干预后肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的改变情况,并探索IL-9对肝癌细胞生物学行为生产影响的可能机制。方法:体外培养SMMC-7721细胞至对数生长期,将SMMC-7721细胞分成实验组和对照组,实验组分别予12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL的重组人IL-9处理,对照组不予任何干预。干预细胞24h后,CCK8法检测肿瘤细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率;Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。留取培养基上清ELISA检测上清中MMP-2,MMP-9和VEGF水平。提取细胞RNA后RT-PCR检测MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA水平。提取细胞蛋白后Western-blot法检测细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3表达水平。在探索IL-9对SMMC-7721细胞产生影响的机制的研究中,实验组分别予50ng/mL IL-9、50 ng/mL IL-9+40umol/L AG490处理,对照组不做任何处理。干预细胞24h后,CCK8法检测肿瘤细胞增殖情况;Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。Western-blot法检测细胞中STAT3和p-STAT3表达水平,RT-PCR检测MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA水平。结果:以12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL浓度的IL-9干预SMMC-7721细胞24 h后,SMMC-7721细胞增殖率明显上升,与此同时SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力亦增加(p0.05),且IL-9对SMMC-7721细胞增殖和转移能力的促进作用随着IL-9浓度的增高而增强。但在凋亡实验中并未发现IL-9干预SMMC-7721细胞后,细胞的凋亡率发生明显改变(p0.05)。对培养基上清进行ELISA检测后发现,与对照组相比,实验组在IL-9干预后上清中MMP-2,MMP-9和VEGF水平显著升高(p0.05)。RT-PCR检测结果亦显示,与对照组相比,实验组细胞在IL-9干预后细胞中MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA的表达水平升高(p0.05)。与对照组比较,IL-9干预后SMMC-7721细胞中的JAK2、STAT3蛋白水平无明显改变(p0.05),但p-JAK2、p-STAT3表达水平显著增高(p0.05)。使用AG490预处理后,IL-9对SMMC-7721的增殖和转移的促进作用被削弱(p0.05),且p-STAT3、MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA的表达水平亦显著降低(p0.05)。结论:IL-9以浓度依赖性促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,但对细胞凋亡无显著影响。IL-9对肝癌细胞生物学行为的促进作用是通过激活STAT3磷酸化,促进MMP-2,MMP-9和VEGF表达实现的。第二部分抗IL-9抗体对肝癌恶性腹水抑制作用的实验研究目的:检测肝癌恶性腹腔积液小鼠模型外周血和恶性腹腔积液中IL-9、IFN-γ浓度,检测肝癌恶性腹腔积液小鼠模型脾脏中Th9、Th1细胞比率。探索腹腔注射抗IL-9抗体治疗肝癌恶性腹腔积液的疗效及作用机制。方法:取传代第7天H22肝癌腹水小鼠1只,吸取小鼠腹腔乳白色瘤液后,用生理盐水将细胞悬液浓度调整为1×10~7/mL。然后将0.2 ml(相当于瘤细胞数2×10~6/只)肿瘤细胞悬液注射到每只小鼠腹腔内,制备H22肝癌腹水小鼠模型。造模2周后ELISA检测模型小鼠腹水和外周血中IL-9、IFN-γ浓度,流式细胞术检测其脾脏中Th9、Th1细胞比例。然后于造模24h后将60只小鼠随机分成三组,即空白对照组、阴性对照组和实验组。空白对照组给予腹腔注射生理盐水,阴性对照组给予腹腔注射同型IgG抗体,实验组给予腹腔注射抗IL-9抗体,隔天一次,共注射5次。每次注射前均称量各组小鼠体重,测小鼠腹围,并观察小鼠日常活动状态。末次用药结束24h后每组处死5只小鼠,测量MA体积,收集MA上清采用ELISA法检测MA中VEGF?IL-9、IFN-γ表达水平。留取小鼠脾脏,分离脾脏中淋巴细胞,采用刺激阻断剂预处理4个小时后,进行表面CD4抗原染色,然后破膜进行胞内IL-9,IFN-γ染色,染色后流式细胞术检测脾脏中Th9细胞、Th1细胞比例。末次用药结束24h后每组取5只小鼠,每只小鼠予静脉注射浓度为50 mg/ml的伊文蓝各0.2 ml,注射2h后收集腹水,离心后留取上清,然后用酶标仪检测腹水上清的吸光度值。其余小鼠观察其生存时间。结果:与正常对照组小鼠对比,H22肝癌腹水小鼠腹水中IL-9、IFN-γ浓度升高,脾脏中Th9细胞、Th1细胞比例升高,差异有统计学意义(p0.05);干预后实验组、阴性对照组和空白对照组小鼠MA的体积分别为(8.44±1.13)mL、(10.88±1.35)mL、(10.56±2.10)mL,与照组相比实验组小鼠MA的体积显著减少,差异有统计学意义(p0.05)。实验组小鼠中位生存时间为18天(17-20天),显著长于阴性对照组14天(13-17天)和空白对照组14天(13-16天),Log-rank检验显示与阴性对照组和空白对照组相比,实验组小鼠生存时间显著延长,差异有统计学意义(p0.05);与阴性对照组和空白对照组相比,实验组H22肝癌腹水小鼠腹水上清中VEGF、IL-9水平显著降低,差异有统计学意义(p0.05),但3组间IFN-γ水平比较差异无统计学意义(p0.05)。三组小鼠腹水上清的平均吸光度值为1.82±0.14,1.78±0.08和1.25±0.09,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组小鼠腹水中伊文蓝浓度显著下降(p0.05)。流式细胞术检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组小鼠给予抗IL-9抗体治疗后脾脏中Th9细胞和Th1细胞比例下降,差异有统计学意义(p0.05)。结论:H22肝癌腹水小鼠腹水中IL-9、IFN-γ浓度升高,脾脏中Th9细胞、Th1细胞比例升高;腹腔注射抗IL-9抗体治疗可能通过降低体内IL-9水平,减少Th9细胞形成,促使肿瘤细胞表达VEGF下降从而减轻H22肝癌腹水小鼠的腹膜血管渗透性,减少腹水的形成,延长H22肝癌腹水小鼠的存活时间。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

形态图,形态,细胞形态,细胞

白介素 9 在肝癌及其所致恶性腹腔积液中的作用及机制研究 20二、结果1. IL-9 对 SMMC-7721 细胞形态学影响为探索 IL-9 是否对肝癌细胞存在直接毒性作用，本研究观SMMC-7721 细胞后细胞形态的改变情况。将 SMMC-7721 细胞生长期，分别在培养基内加入终浓度为 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL,重组人 IL-9 进行干预，37℃培养 24 小时后，光镜下观察细胞形示与未进行 IL-9 干预组相比，SMMC-7721 细胞形态并无显著改积未见明显的缩小，与周围的细胞无脱离。见图 1。

流式细胞术,抗肿瘤作用,细胞凋亡,抗肿瘤药物

2. IL-9 对 SMMC-7721 细胞凋亡的影响肿瘤是一种细胞凋亡过少而增殖过多的疾病,目前临床上的多种抗肿瘤药物的抗肿瘤作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡起作用的。为探索 IL-9 对肝癌细胞是否存在直接抗肿瘤作用，本研究在形态学观察的基础上，采用流式细胞术检测 IL-9 干预后 SMMC-7721 细胞的凋亡情况。将培养 SMMC-7721细胞至对数生长期，分别在培养基内加入终浓度为 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL,50 ng/mL 的重组人 IL-9 进行干预，37℃培养 24 小时后，收集细胞进行流式检测，结果显示与未进行 IL-9 干预组相比，SMMC-7721 细胞的凋亡率未见明显改变。见图 2。

情况,癌细胞系,迁移能力,肝癌细胞

图 3. IL-9 干预后 SMMC-7721 细胞增殖情况。SMMC-7721 细胞增殖率随 IL-9 的浓度<0.05）。Figure 3 Proliferation of SMMC-7721 cells after IL-9 intervention. Proliferation of SMMCwith elevated of IL-9 concentration.4. IL-9 促进 SMMC-7721 细胞的迁移和侵袭能力迁移和侵袭能力是恶性肿瘤的特性，恶性肿瘤的转移是肿瘤的主要原因。在本研究中，为探讨 IL-9 对肝癌细胞迁移、侵袭能我们用 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL 浓度的重组人 IL-9 干预SMMC-7721 细胞，采用 Transwell 法观察肿瘤细胞迁移能力的变结果表明，与未予 IL-9 干预的对照组相比，外源性 IL-9 干预可癌细胞系 SMMC-7721 的迁移和侵袭能力（p<0.05），且这种促

【参考文献】