RNF43点突变在胆囊癌发生发展中的作用及分子机制

发布时间：2020-08-12 05:53

【摘要】：研究背景及目的胆囊癌在消化道恶性肿瘤中发病率排名第6位,其预后极差,死亡率接近发病率。胆囊癌早期缺乏特异性临床表现,如今根治性手术切除是唯一的治愈手段,但术后易出现复发转移。基因突变在肿瘤发生过程中发挥着重要作用,而对于肿瘤驱动基因的研究不仅揭示肿瘤发生的原因,更重要的是可以以此为切入点,探索治疗方式。环指蛋白43(Ring finger protein 43,RNF43)作为Wnt信号转导通路的抑制因子,在个体发育、细胞增殖分化等方便发挥重要调控作用。RNF43在胆囊癌中存在较高的突变频率,与胆囊癌的发生具有密切关系,值得进一步研究。方法1.通过TOPflash/FOPflash双荧光素酶报告基因系统实验及qPCR检测Wnt通路下游靶基因转录变化,明确RNF43对Wnt通路的抑制作用,确定Y332*点突变对RNF43功能的影响。2.体外细胞学实验探究RNF43及其突变体Y332*对胆囊癌细胞增殖、侵袭能力的影响。3.结合蛋白交联、串联亲和纯化及串联质谱,确定RNF43的相互作用蛋白,并通过CO-IP验证RNF43点突变Y332*对蛋白互作的影响。4.通过Real-Time qPCR检测40例胆囊癌患者癌与癌旁组织中RNF43表达情况,并与患者预后及临床病理信息进行综合分析,探究RNF43的功能变化与胆囊癌发生发展及预后转归的关系。结果1.RNF43在胆囊癌细胞中对Wnt信号通路具有抑制作用;2.RNF43截短突变Y332*对Wnt信号通路的抑制作用部分缺失,可能和其DVL结合结构域缺失有关;3.体外细胞学实验发现,RNF43及点突变Y332*对胆囊癌细胞系的增殖迁移功能没有明显影响;4.发现RNF43能与蛋白PRMT5相互作用,而Y332*突变可削弱二者的结合能力;5.通过胆囊癌mRNA差异表达检测发现RNF43表达在癌与癌旁组织中差异不显著;6.RNF43的表达水平与胆囊癌的发展及患者的预后无明显相关性。结论虽然本研究结果未见RNF43与胆囊癌的发展具有相关性,但仍不能排除RNF43的功能缺失在胆囊上皮恶变过程中的作用。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.8
【图文】：

真核表达载体,图谱

上海交通大学博士学位论文2.2.2.2 琼脂糖凝胶配制及 PCR 产物电泳称取 0.3 g 琼脂糖粉末，加入 30 ml 1×TAE 缓冲液中，混匀后放入微波炉中高火加热 30 秒，反复 3 次，确定琼脂糖充分溶解后取出。室温冷却至 50℃左右，加入 3 μl GEL-RED 染液，充分混匀后倒入模具，插上合适宽度的齿梳，室温冷却 30 分钟。PCR 产物中加入 6×DNA Loading Buffer 至 1×浓度，混匀后加入凝胶的上样孔中。在 1×TAE 缓冲液中，120V 恒压电泳 30 分钟。结束电泳后在紫外切胶仪下切下目的条带，置入 1.5ml effendorf 管中。2.2.2.3 凝胶内 DNA 回收将凝胶用枪头捣碎后称重，加入凝胶 3 倍体积的 buffer A（100 mg=100 μl），置于 70℃金属浴中加热 6-8 分钟，直至凝胶充分溶解。每 2 分钟颠倒震荡一次EP 管。加入 buffer A 体积一般的 buffer B，确保溶液颜色完全由红变黄。将溶液转移至吸附柱中，14000 g 室温离心 30 秒，弃去收集管内的液体。加入 500 μlPW1，14000 g 室温离心 30 秒。再加入 700 μl PW2，14000g 室温离心 30 秒。重复 1 次后，吸附柱空转离心 1 分钟，以保证 PW2 中的乙醇彻底除去。加入 25 μlElution Buffer，室温静置 1 分钟后，14000 g 离心 1 分钟。收集洗脱液，用 NanoDrop 2000 测定 DNA 浓度及纯度。2.2.2.4 质粒载体及 PCR 产物双酶切

免疫荧光,标尺

上海交通大学博士学位论文将 20 μl 裂解液加入 96 孔板中，上机检测。萤火虫荧光素酶底物每孔加入 50 μl，检测后再加入反应终止液和海肾荧光素酶底物。继续检测。海肾荧光值矫正各孔萤火虫荧光值后，用同一处理的 TOPflash 组与 Fopflash 组的萤火虫荧光的比值表示 Wnt 通路激活程度。3 实验结果3.1 RNF43 及 Y332*突变质粒构建及表达效率验证我们为研究 RNF43 蛋白及 Y332*突变的结构及功能，首先构建了相应的过表达质粒。并通过免疫荧光及 WB 验证质粒在胆囊癌细胞系 GBC-SD 中的表达情况。结果显示，RNF43 及截短突变在细胞内成功过表达，且均主要分布于细胞胞膜及胞浆中（图 2）。而 WB 实验发现 RNF43 及突变体存在较多降解条带，可能是在细胞中发生内源性降解(图 3)。考虑到负反馈调控的实时性，即 Wnt 通路激活程度较低时，体内 RNF43 本身的稳定性可能较低，易发生 RNF43 蛋白降解所致。RNF43 Y332*由于截短突变导致蛋白肽链长度缩短，故分子量变小(图 3)。

过表达,条带,细胞系,激活水平

图 3. GBC-SD 中过表达 RNF43 及 Y332*突变的 WB 条带3. The WB bands of RNF43 and Y332* mutant which overexpressed in GB表达水平及突变在胆囊癌细胞系中的情况合适的实验细胞系，我们对 5 株胆囊癌细胞系进行 RNF43 编码果发现，5 株胆囊癌细胞系均含有 RNF43 点突变，但并未发现变均属于但单核苷酸多态性。其中细胞系 NOZ 突变较少。同量 PCR（real time qPCR）检测了 5 株胆囊癌细胞系中 RNF4 信号通路的激活水平。结果显示，NOZ 细胞中 RNF43 表达水平时，Wnt 通路中下游调控基因 AXIN2、MYC 在 NOZ 细胞中亦有见 Wnt 通路在 NOZ 细胞中激活水平较其它细胞株高。因此我们胞系进行进一步研究。表 1：胆囊癌细胞系 RNF43 编码区点突变情况细胞系突变GBC-SD c.a139g c.c1252aNOZ c.g350aSGC996 c.c1854g(杂合)OCUG c.a139g c.c1252a

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