miR-335-3p靶向作用APPL1调控p-Akt信号通路促进结直肠癌细胞的增殖与迁移

发布时间：2020-08-14 12:55

【摘要】：结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一。2015年我国恶性肿瘤数据显示,结直肠癌的发病率位列第4,死亡率位列第5,且呈上升态势,严重威胁我国公民身心健康。结直肠癌的发病受多个基因及多条信号通路的影响。因此,深入探讨结直肠癌相关生长、增殖、转移等分子机制,有利于帮助寻找潜在的生物治疗靶点。miRNA作为具有调控作用的单链RNA小分子,是近年来结直肠癌研究的热点,大量研究显示其在结直肠癌的发生发展过程中扮演着重要角色。研究显示,miR-335在包括结直肠癌在内的许多恶性肿瘤的发病机制中发挥着重要作用。然而,目前miR-335的研究主要集中于miR-335-5p,miR-335-3p的研究相对较少,且在结直肠癌中的研究尚无报道,作为成熟miR-335形成过程中的另一条重要的单链RNA,miR-335-3p在结直肠癌中的具体表达情况以及其在结直肠癌中发挥的功能尚不清楚。因此,我们将miR-335-3p列为潜在参与结直肠癌发病机制的调控因子,开展深入的研究工作。方法:1 miR-335-3p在结直肠癌组织中的表达情况利用采用实时荧光定量PCR(q-PCR)方法检测miR-335-3p在结直肠癌组织中的表达情况。2 miR-335-3p对结直肠癌细胞生物学特性的影响1)体外细胞生物学实验:利用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell小室细胞迁移实验、细胞划痕实验、流式细胞周期检测、流式细胞凋亡检测等方法检测结直肠癌细胞SW480、HT-29转染miR-335-3p mimics和inhibitors后细胞增殖和迁移能力的变化。2)体内细胞生物学实验:通过慢病毒转染技术构建miR-335-3p稳定过表达细胞株,将构建成功的细胞株注射到裸鼠皮下,构建裸鼠皮下成瘤模型,观察miR-335-3p对结直肠癌细胞体内增殖能力的影响。并利用免疫组化技术检测裸鼠皮下种植瘤中Ki67的表达情况。3 miR-335-3p下游靶基因的预测及确认利用在线数据库和DAVID通路富集分析预测和筛选靶基因,运用双荧光素酶报告基因实验验证靶基因。4 APPL1在结直肠癌中的表达情况及其对结直肠癌细胞生物学特性的影响构建APPL1过表达质粒,利用细胞功能实验方法检测结直肠癌细胞过表达APPL1后细胞增殖和迁移能力的变化。5 miR-335-3p靶向调控APPL1促进结直肠癌细胞的增殖与迁移机制运用DAVID生物信息学分析技术,结合Western blot技术检测过表达或抑制miR-335-3p后结直肠癌细胞中相关信号通路蛋白表达水平的变化情况。结果:1 miR-335-3p在结直肠癌组织中的表达上调。86对配对结直肠癌组织q-PCR检测及TCGA数据分析结果显示:miR-335-3p在结直肠癌组中的表达水平显著高于正常对照组(P0.01)。2 miR-335-3p的表达上调可能与结直肠癌转移相关,可能是结直肠癌患者病情评估的一个重要指标。对86对结直肠癌患者临床资料进行统计学分析,X 2检验结果显示:miR-335-3p的表达与淋巴结转移(P=0.002)及AJCC分期(P=0.003)密切相关,提示miR-335-3p的表达上调可能与结直肠癌转移相关,可能是结直肠癌患者病情评估的一个重要指标。3过表达miR-335-3p促进结直肠癌细胞的增殖与迁移,抑制miR-335-3p则相反。4 miR-335-3p促进结直肠癌细胞周期G1/S期转化。流式细胞周期检测结果显示:SW480和HT-29过表达miR-335-3p mimic后,G1/G0期细胞数较对照组显著减少(P0.05),S期细胞显著增加(P0.05);抑制组则相反(P0.05);Western blot结果显示CCND1、CDK2、CDK4、CDK6、pRb的表达水平在miR-335-3p过表达组明显高于对照组,抑制组则相反,提示miR-335-3p促进结直肠癌细胞G1期向S期转化。5 miR-335-3p抑制结直肠癌细胞凋亡。流式细胞凋亡检测结果显示:过表达miR-335-3p可抑制结直肠癌SW480和HT-29细胞的凋亡,而抑制则相反(P0.05);Western blot结果显示细胞凋亡相关蛋白表达下调,提示miR-335-3p抑制结直肠癌细胞的凋亡。6 APPL1是miR-335-3p的靶基因。利用双荧光素酶报告基因实验,证实APPL1是miR-335-3p的靶基因。7 APPL1在结直肠癌组织中表达下调,且APPL1抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移(P0.05)。8 miR-335-3p靶向作用APPL1调控p-Akt信号通路促进结直肠癌细胞的增殖与迁移。Westernblot检测结果显示:过表达miR-335-3p后,p-Akt的表达水平明显上调,p21、p27、Cleaved-casp9的表达水平明显下调;而过表达APPL1后,此作用减弱。提示miR-335-3p通过靶向作用APPL1调控p-Akt-p27/p21促进细胞周期转化、p-Akt-Casp9抑制细胞凋亡,进而促进结直肠癌细胞的增殖;通过APPL1-p-Akt促进结直肠癌细胞的迁移。结论:本研究系统地探讨了miR-335-3p及其靶基因APPL1在结直肠癌中的表达及作用;探讨了miR-335-3p作为促癌因子通过APPL1-p-Akt信号通路促进结直肠癌细胞的增殖与迁移的作用机制,为结直肠癌发病机制的研究及未来治疗方向提供了新的思路。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34
【图文】：

结直肠癌,表达水平,数据库,临床特征

逦１逡逑＊＊：邋＾＜０．０１逡逑图１－１．邋ｍｉＲ－３３５＿３ｐ在８６对结直肠癌组织中的表达水平。Ｎｏｒｍａｌ：正常癌旁组织；Ｔｕｍｏｒ：逡逑结直肠癌肿瘤组织。逡逑Ｆｉｇｕｅ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－３３５￣３ｐ邋ｉｎ邋８６邋ｐａｉｒｓ邋ｏｆ邋ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ逡逑ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｉｒ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｔｉｓｓｕｅｓ．逡逑Ｗ）逦Ｑ．逡逑ｐ邋＝邋１．２３４ｅ－０６逦Ｊ逦ＴＣＧＡ邋ｄａｔａｂａｓｅ逡逑Ｑ．逡逑ｘ邋１５－｜逦ａ逦１0－逡逑卜邋ｍｅｍ邋＾邋＾逡逑．．．．逡逑＾逦－逦２－逡逑？Ｃ邋０逦ｉ逦■邋■逦ｏ逦０逦ｉ逦ｉ逡逑Ｎｏｒｍａｌ邋（ｎ邋＝邋２邋Ｔｕｍｏｒ邋（ｎ邋＝邋４ｆ逦Ｎｏｒｍａｌ邋（ｎ邋＝邋２邋Ｔｕｍｏｒ邋（ｎ邋＝邋３逡逑图１－２．邋ＴＣＧＡ结直肠癌数据库显示ｍｉＲ－３３５的表达水平。逡逑Ｆｉｇｕｅ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－３３５邋ｉｎ邋ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｄａｔａｓｅｔ逡逑ｏｆ邋ＴＣＧＡ邋（ｎ＝４５７）．逡逑２邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ表达水平与患者相关临床特征学的关系逡逑为了探讨ｍｉＲ－３３５－３ｐ表达水平与患者临床特征学的相关性，我们对８６对结逡逑直肠癌组织患者临床资料进行了统计学分析，Ｘ２检验分析显示：ｍｉＲ－３３５－３ｐ的逡逑表达与淋巴结转移（芦０．邋００２）及ＡＪＣＣ分期（／Ｍ３．邋００３）密切相关（表１－１）

结直肠癌,表达水平,临床特征,患者

Ｎｏｒｍａｌ邋（ｎ邋＝邋２邋Ｔｕｍｏｒ邋（ｎ邋＝邋４ｆ逦Ｎｏｒｍａｌ邋（ｎ邋＝邋２邋Ｔｕｍｏｒ邋（ｎ邋＝邋３逡逑图１－２．邋ＴＣＧＡ结直肠癌数据库显示ｍｉＲ－３３５的表达水平。逡逑Ｆｉｇｕｅ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－３３５邋ｉｎ邋ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｄａｔａｓｅｔ逡逑ｏｆ邋ＴＣＧＡ邋（ｎ＝４５７）．逡逑２邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ表达水平与患者相关临床特征学的关系逡逑为了探讨ｍｉＲ－３３５－３ｐ表达水平与患者临床特征学的相关性，我们对８６对结逡逑直肠癌组织患者临床资料进行了统计学分析，Ｘ２检验分析显示：ｍｉＲ－３３５－３ｐ的逡逑表达与淋巴结转移（芦０．邋００２）及ＡＪＣＣ分期（／Ｍ３．邋００３）密切相关（表１－１），逡逑提示ｍｉＲ－３３５－３ｐ的表达上调可能与结直肠癌转移相关

慢病毒,荧光显微镜,转染,体外增殖

Ｉ逦Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ逡逑＊＊：／＜０．０１逡逑图２－４．邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ过表达病毒转染效率验证。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２＿４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｉｃａｃｙ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ邋ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｖｉｒｕｓ邋ｗｅｒｅ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ｑ－ＰＣＲ．逡逑４邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ对结直肠癌细胞增殖的影响逡逑４．１邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ促进结直肠癌细胞的体外增殖逡逑利用邋ＣＣＫ８邋增殖实验检测邋ＳＷ４８０－ｍｉＲ－３３５－３ｐ／ＳＷ４８０－ＮＣ，ＨＴ－２９－ｍｉＲ－３３５－３ｐ／逡逑ＨＴ－２９－ＮＣ细胞的体外增殖能力，结果显示：ＳＷ４８０和ＨＴ－２９细胞ｍｉＲ－３３５－３ｐ过逡逑表达ｍｉｍｉｃｓ组的增殖速率均显著高于对照（ＮＣ）组（图２－５，表２－４、２－５，户逡逑＜０．０５），其中ＳＷ４８０于第３天增殖差异最大（图２－５，表２－４，邋／＜０．０１）；逡逑ｍｉＲ－３３５－３ｐ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ组的细胞增殖速率则均显著低于对照（ＮＣ）组（图２－５，逡逑表邋２－４、２—５，户＜０．０５）。逡逑同时

【相似文献】