NF-κB信号通路激活与大肠癌发生相关关系的分子机制研究

发布时间：2020-08-14 15:00

【摘要】：大肠癌(Colorectal cancer CRC)是全球范围内与癌症有关的死亡的主要原因之一,局部侵袭性和远处转移是导致大肠癌死亡的主要原因,其分子发病机制尚需进一步的阐明。大规模测序和其他基因分析的最新研究为大肠癌增殖和侵袭分子机制的进一步研究提供了新的机会。NF-κB信号通路是一个新的研究方向。NF-κB信号通路在正常组织和各种癌症组织的增殖、发展和存活中起重要作用。增殖诱导配体(A proliferation-inducing ligand,APRIL)是肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)超级家族的成员,是可以刺激细胞增殖的细胞因子。APRIL在一些癌症(如结肠癌和胰腺癌)组织细胞中高表达,APRIL可以通过交联TNF受体TACI(TNFRSF13B)激活典型的NF-κB信号通路。E-钙粘蛋白(E-cadherin)是介导上皮组织中钙依赖性细胞-细胞粘附的跨膜糖蛋白的主要成员。通过抑制细胞和阻止细胞运动而阻断肿瘤细胞侵袭正常组织。E-钙粘蛋白接受转录抑制子Snail的负调控,并且细胞内Snail的稳定水平依赖于NF-κB(p65或RelA)信号的激活。APRIL在结肠直肠癌组织和细胞系中高度表达。在本研究中第一部分,探讨了APRIL-p65 NF-κB-Snail信号调节CRC中E-钙粘蛋白的假设。发现在结肠癌组织和结肠癌细胞系T84中Snail的表达与Ecadherin的表达呈负相关。此外,APRIL在蛋白水平调控Snail,而并没有在mRNA水平调节。并且COP9信号体亚基2(CSN2)在mRNA和蛋白质水平上阻断Snail的泛素化和降解。同时,通过siRNA沉默T84细胞p65基因,可以导致Snail蛋白质水平上调,但对其mRNA水平无影响。此外,Snail的沉默导致E-钙粘蛋白E-钙粘蛋白和mRNA水平均降低。这些结果表明,APRIL-p65NF-κB-Snail信号转导在调节E-钙粘蛋白中起关键作用,对结肠癌中旁分泌炎症诱导的转移新机制有更深入了解。细胞增殖在肿瘤发生中起关键作用,环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)是这一过程中重要的调控酶。COXs催化游离花生四烯酸转化为前列腺素(Prostaglandin,PG)H2,后者是其他前列腺素和血栓素的前体。PGs在各种生物过程中起作用,如细胞增殖,血管生成,免疫功能和炎症,这些在肿瘤的发展或进展中都是至关重要的。环氧合酶家族包括COX-1,COX-2和COX-3。COX-2在组织转化和增生的发展中起重要作用,同时在肿瘤的发展和恶化中扮演重要角色。COX-2已被证实可以调节细胞的增殖和转化,以及肿瘤的生长、转移和侵袭。具有高水平COX-2的肿瘤更具侵袭性,患者的生存率显著降低。反之,抑制COX-2有助于控制肿瘤的生长和侵袭。在多种组织中,NF-κB是产生COX-2的重要调节因子。活化的NF-κB通过介导促炎症基因(趋化因子、细胞因子、粘附分子和生长因子)的表达,从而在炎症和免疫反应中起重要调节作用。另外,NF-κB的靶点也是细胞增殖的重要调节因子。然而COX-2影响调控结肠癌中的机制尚不明确。在第二部分中,探讨了COX-2在人结肠组织和人结肠癌细胞系LS174中表达调控机制。非诱导激活的非经典的NF-κB信号通路(NF-κB2(NF-κB)-2(p52))作为内源性刺激信号,通过与COX-2基因启动子的NF-κB增强子结合来调节COX-2。通过免疫组织化学显示,与正常组织相比,COX-2在结肠癌组织中显著增加。在结肠癌组织和结肠癌细胞系LS174中也观察到RelB和p52的细胞核水平增加。这种关系通过染色质免疫沉淀实验进一步确定。荧光素酶报告基因检测显示COX-2的NF-κB增强子足以调节LS174细胞中异源启动子的转录活性。RNA干扰介导的RelB或p52的敲低导致LS174细胞中COX-2的mRNA和蛋白质显著抑制。这些结果表明:经典和非经典的NF-κB信号通路在CRC的发生、发展、局部侵犯、以及远处转移均起着重要的作用。因此NF-κB信号通路可能是治疗结肠癌的一新型并有效的药物靶点。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34
【图文】：

E-钙粘蛋白,免疫组织化学染色,结肠癌,图像

第二部分研究内容第 1 章 APRIL-NF-κB-Snail 信号调节结肠癌中的 E-钙粘蛋白的研究1.3 结果1.3.1 TACI，Snail 和 E-钙粘蛋白在结肠癌和癌旁组织中的表达TACI，Snail 和 E-钙粘蛋白在 25 例结肠癌和癌旁组织标本中表达情况的免疫组化染色图片，见图 1.1。TACI，Snail 和 E-钙粘蛋白，在 25 例结肠癌和癌旁组织标本中表达情况的染色强度，见表 1.3，在低分化腺癌中分别为 1.7±0.522.1±0.75 和 1.8±0.11，在高分化腺癌中分别为 1.5±0.83, 2.8±0.63 和 0.5±0.23，低分化或高分化腺癌与 Snail或 E-钙粘蛋白相邻的非癌组织比较时，差异有统计学意义（p < 0.05）。Snail主要定位于腺癌的细胞核中，而在非癌性组织则定位于细胞质的，这些结果表明，在 CRC中，Snail与 E-钙粘蛋白的表达呈负相关。

E-钙粘蛋白,免疫荧光染色,细胞内,细胞核

染色强度TACI Snail E-钙粘蛋)癌 (10)癌 (15)1.7 0.52 2.1 0.75* 0.8 0.11.5 0.83 2.8 0.63* 0.5 0.2=25) 1.8 0.42 1.5 0.32 1.9 0.5数据以平均值 M SD 表示CI，Snail 和 E-cadherin 在结肠癌细胞株 T84 中的表达荧光染色确定结肠癌细胞系 T84 中 TACI，Snail 和 E-钙如图 1.2 所示），观察到在 T84 细胞中 TACI，Snail 和癌组织免疫组织化学染色结果一致。Snail 作为转录阻遏，E-钙粘蛋白在细胞株中不表达。提示 Snail 和 E-钙粘的表达情况亦呈负相关。

示意图,途径,蛋白质水平,示意图

1.3.3 p65的抑制阻断了 APRIL 诱导的结肠癌 T84 细胞中 Snail 的稳定表达有研究表明炎性细胞因子 TNFα可以通过 NF-κB 途径稳定 Snail 的转录，并且 NF-κB 是诱导 CSN2 所必需的，其阻止了 Snail 泛素化和降解[99]。因此我们假设 APRIL 通过激活 p65 / p50 NF-κB 信号通路来诱导 CSN2的表达，反过来稳定了结肠癌中的 Snail（图 1.3A）。使用 siRNAs 转染结肠癌细胞来沉默 p65，以非靶向 siRNA作为对照。如图1.3B 所示，APRIL 处理后导致 CSN2 在 mRNA 和蛋白质水平均增加，然而，Snail仅在蛋白质水平增加， mRNA水平没有增加。同时，沉默 p65 后，CSN2 在 mRNA 和蛋白质水平明显降低，而 Snail 仅在蛋白质水平下调，但在 mRNA水平上变化不大。图 1.3C 中，使用 ChIP 来确定 p65 和 CSN2 基因启动子之间的直接相互作用，显示 APRIL 处理导致 CSN2 基因启动子处 p65富集增加约 3 倍。

【参考文献】