Ghrelin对癌症恶病质骨骼肌消耗的治疗作用及其机制研究

发布时间：2020-08-14 18:43

【摘要】：目的:癌症恶病质是由多种因素相互作用所导致的一种重要的疾病综合征,主要表现为进行性的骨骼肌萎缩,严重影响恶性肿瘤患者的生活质量及预后。癌症恶病质的骨骼肌萎缩是多种机制共同作用造成的结果,这些机制包括骨骼肌细胞蛋白代谢失衡、骨骼肌细胞损伤以及骨骼肌再生障碍等。目前尚无有效的临床治疗方法用于缓解癌症恶病质的肌肉萎缩。Ghrelin为具有多种生物学活性的小分子多肽,辛酰化ghrelin(AG)和非辛酰化ghrelin(UnAG)均可以缓解多种疾病导致的骨骼肌萎缩,但其能否治疗癌症恶病质的骨骼肌萎缩却鲜有报道,具体作用机制也尚不明确,值得进一步研究。本研究通过体外细胞共培养模型和癌症恶病质小鼠模型探讨:(1)Ghrelin对共培养环境下肌管细胞萎缩的影响及其机制;(2)Ghrelin对共培养环境下成肌细胞凋亡的影响及其机制;(3)Ghrelin对癌症恶病质小鼠骨骼肌消耗的治疗作用及其机制。本研究为进一步明确ghrelin对癌症恶病质骨骼肌萎缩的治疗机制及其临床应用提供更多理论依据。方法:第一部分:小鼠C2C12成肌细胞诱导分化为肌管细胞并鉴定;肌管细胞与CT26细胞共培养,观察不同共培养时间对肌管细胞肌蛋白代谢的影响;将不同浓度的AG或UnAG分别作用于肌管细胞和CT26细胞,观察其对细胞活性和增殖的影响;将不同浓度的AG或UnAG作用于共培养的肌管细胞24小时,观察其对肌管细胞肌蛋白代谢的影响;将AG或UnAG作用于正常或共培养的肌管细胞,检测其对肌蛋白代谢调节因子的表达和活性以及培养基中促炎因子和myostatin含量的影响。第二部分:C2C12成肌细胞与CT26细胞共培养,观察不同共培养时间对成肌细胞凋亡的影响;将不同浓度的AG或UnAG作用于共培养的成肌细胞24小时,观察其对成肌细胞凋亡的影响;将AG或UnAG作用于正常或共培养的成肌细胞,检测细胞内线粒体功能以及凋亡途径相关蛋白和凋亡调控相关蛋白的表达和活性,并且通过使用SP600125和LY294002这两个信号通路抑制剂,进一步明确这些调控机制的参与。第三部分:将CT26细胞接种于雄性BALB/c小鼠背部皮下成瘤,构建癌症恶病质小鼠模型,观察AG或UnAG的干预对癌症恶病质小鼠骨骼肌萎缩、血清生化指标和促炎因子含量的影响,并检测其对骨骼肌内肌蛋白代谢调节因子的表达和活性的影响。结果:第一部分:(1)共培养可以引起明显的肌管细胞萎缩和MHC含量减少,AG及UnAG的干预可以缓解这些变化。(2)AG及UnAG作用于共培养的肌管细胞后可以抑制细胞内钙蛋白酶、NF-κB及FoxO3a的过度激活,上调细胞内Akt活性,减少atrogin-1和MuRF1的表达,并降低细胞内的自噬水平。(3)AG及UnAG可以减少共培养的肌管细胞内TNF-α和myostatin的表达和分泌,从而减少培养基内TNF-α和myostatin的含量。第二部分:(1)共培养可以引起成肌细胞线粒体膜电位丧失和线粒体蛋白释放,引起成肌细胞内caspase-3片段、PARP片段以及核小体碎片的增加,并且增加成肌细胞凋亡率,AG及UnAG的干预可以缓解这些变化。(2)共培养可以引起成肌细胞内JNK的激活并且抑制Akt的活性,从而增加胞质内tBid含量和线粒体上Bax的含量,并且减少线粒体上Bcl-2含量,AG及UnAG可以在一定程度上抑制这些变化。第三部分:(1)AG及UnAG增加荷瘤小鼠肌组织和脂肪组织的重量以及肌纤维的横截面积,抑制荷瘤小鼠腓肠肌内钙蛋白酶系统的异常激活、游离肌丝的产生以及atrogin-1的表达。(2)AG及UnAG增加荷瘤小鼠腓肠肌内Akt活性,并且减少FoxO3a的表达和活性。(3)与正常组相比,恶病质小鼠血清总蛋白和白蛋白含量下降,血糖降低,血清甘油三酯含量升高,AG及UnAG的干预可以缓解这些改变。(4)恶病质小鼠血清TNF-α和IL-1β含量明显高于正常组,AG及UnAG能不同程度地逆转这些改变。结论:(1)本研究第一部分采用的共培养模型可以诱导肌管细胞萎缩和肌蛋白代谢异常,可以在一定程度上模拟癌症恶病质下肌纤维的体内环境。(2)共培养体系内的CT26细胞和肌管细胞可以通过各自分泌的细胞因子相互作用,这些因子通过影响多个调控肌蛋白代谢的通路而引起肌管细胞萎缩。AG及UnAG通过抑制钙蛋白酶活性而影响这些肌蛋白代谢调节通路,从而在促进肌蛋白合成的同时也抑制肌蛋白分解,缓解共培养引起的肌管细胞萎缩,表明AG及UnAG具有治疗癌症恶病质骨骼肌肌蛋白代谢失衡的潜能。(3)本研究第二部分采用的共培养模型可以诱导成肌细胞凋亡,可以在一定程度上模拟癌症恶病质下成肌细胞的体内环境。(4)共培养可以引起成肌细胞内JNK的激活并且抑制Akt的活性,从而影响Bcl-2蛋白家族并激活线粒体凋亡途径,引起细胞凋亡。AG及UnAG可以抑制JNK的活性和再激活Akt,从而抑制线粒体凋亡途径的激活,减少共培养的成肌细胞的凋亡,表明AG及UnAG具有治疗癌症恶病质骨骼肌再生障碍的潜能。(5)AG及UnAG可以抑制荷瘤小鼠骨骼肌内钙蛋白酶系统的激活,从而减少肌原纤维分解。通过抑制钙蛋白酶系统的激活,AG及UnAG可以增加荷瘤小鼠骨骼肌内Akt的活性,从而抑制FoxO3a的活性,下调atrogin-1的表达,减少肌蛋白降解,抑制骨骼肌萎缩。AG及UnAG还可以改善癌症恶病质小鼠的营养物质代谢,并且减少血清促炎因子含量,从多个方面对癌症恶病质起到治疗作用。我们的研究表明AG及UnAG有望成为治疗癌症恶病质的新方法。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730
【图文】：

成肌细胞,诱导分化

实验结果1.成肌细胞向肌管细胞的诱导分化及鉴定C2C12 为 Yaffe[15]等人于 1977 年首先建立的小鼠成肌细胞株，其在完全培养基中可以不断进行分裂增殖，而在分化培养基中单核的星形成肌细胞可以分化并相互融合成为多核的长条形肌管细胞。分化过程中，细胞持续表达生肌分化因子 D（MyoD）和肌细胞生成素（myogenin）等促肌合成因子并且合成肌球蛋白（myosin）等肌蛋白[16, 17]。实验中通过对细胞内肌球蛋白重链（MHC）进行细胞免疫荧光检测，我们观察到，成肌细胞经诱导分化后，细胞形态发生改变，出现多核长条形细胞，且该细胞 MHC 检测阳性（如图 1A 所示）。同时，WB结果表明，诱导分化后的细胞高表达 MyoD、myogenin 及 MHC（如图 1B 所示）。以上实验结果表明，经诱导分化后，成肌细胞已成功分化成为肌管细胞。

肌蛋白,直径,共培养,药物浓度

图 2. 不同共培养时间对肌管细胞直径和肌蛋白代谢的影响。（A）肌管细胞免疫荧光染色结果。放大倍率为 100 倍，标尺为 100μm。（B）肌管细胞直径分析。各组肌管细胞的直径都标准化至 NC 组的均值。（C）肌管细胞内 MHC 的蛋白含量。（D）MHC 蛋白含量的灰度分析。各组 MHC 蛋白的灰度值均标准化至相应的 NC 组的均值。（*P < 0.05, **P <0.01, ***P < 0.001）3. 不同浓度的 AG 或 UnAG 对共培养环境下肌管细胞直径和肌蛋白代谢的影响在选择作用于细胞的 AG 或 UnAG 浓度时，我们主要参考既往文献报道的10nM 和 100nM[18-21]，同时我们也检测更低（1nM）和更高（1uM）的药物浓度。在细胞毒性实验中，这 4 种浓度的 AG 或 UnAG 均未表现出对肌管细胞的细胞毒性（如图 3 所示）。将不同浓度的 AG 或 UnAG 作用于共培养的肌管细胞 24h 后，我们发现，10nM、100nM 和 1uM 的 AG 或 UnAG 可缓解共培养导致的肌管细胞萎缩，且 100nM 药物浓度的效果强于 10nM，但 1uM 和 100nM 的作用效果无明显差异，而 1nM 的药物浓度未表现出缓解效果（如图 4A、4B 所示）。这一结果

对正,药物浓度,梯度

图 3. 不同浓度的 AG 及 UnAG 对正常肌管细胞活性的影响。CCK8 法测定药物浓度梯度增加的 AG 或 UnAG 干预后肌管细胞的活性，各组之间无显著差异（P > 0.05）。

【参考文献】