CXCL12-G801A基因多态性与我国汉族人群非小细胞肺癌发病风险的相关性研究

发布时间：2020-08-15 20:01

【摘要】：研究背景与目的肺癌约占全部恶性肿瘤死亡率的20%,是目前全球癌症死亡的主要原因,其中超过80%的是非小细胞肺癌(NSCLC)。世界卫生组织(WHO)公布的资料显示：肺癌无论是发病率(120万/年)还是死亡率(110万/年)均居全球癌症首位,并且其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。根据我国肿瘤防治办公室公布的资料：从上世纪70年代至今,我国肺癌死亡率上升了近5倍。大量的研究调查显示：吸烟与肺癌的发病密切相关,吸烟者比不吸烟者肺癌发生的几率高近10倍。中国目前拥有着超过全球1/3的吸烟人群,由于肺癌发病率变化与吸烟率相比约滞后20-30年,在不久的将来,肺癌发病和死亡所占的比重在全球范围内将更加突出。由此可见,肺癌已成为威胁全球及我国居民生命和健康的重要疾病之一,是函待解决的重大公共卫生问题。随着肺癌分子生物学研究水平的不断进步,关于非小细胞肺癌遗传基因方向的研究也越来越多。肺癌作为一种多因素、多基因参与的复杂性状疾病,其病因、发病机制及预后影响因素尚不完全清楚,临床诊断及治疗技术水平仍需不断提高。例如,占所有肺癌80%以上的非小细胞肺癌(NSCLC)其5年生存率在美国为15%,在欧洲为10%,而在发展中国家仅为8.9%。尽管NSCLC预后判断和划分的主要依据仍然是临床分期和病理组织学类型,然而,具有相同临床特征的NSCLC患者,采用同样的治疗手段,其预后情况却可能有很大的差异。以铂类化疗为例,铂类药物是非小细胞肺癌(NSCLC)化学治疗的主要和首选药物,然而以铂类为基础的联合化疗方案(如与紫杉醇等联合)对晚期NSCLC的有效率仅约17-37%左右,中位生存期为6.7-11.3月,人们对患者个体间化疗应答差异产生的原因还不十分清楚,然而最新的研究提示我们遗传因素可能在其中起到了关键作用。因此,通过生物标志物对NSCLC患者预后情况进行预测,并采取针对性的个体化治疗(personalized therapy),将有助于改善生存质量,延长患者的生存时间。研究表明,具有相同临床特征及治疗手段的患者,其生存时间的差异一方面与个体体质有关,另一方面也可能受到包括遗传变异在内的遗传因素的影响,因此遗传因素具有成为潜在新的预后预测标志物。人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)研究结果表明,不同个体的基因组99.9%是一样的,在序列上仅存在极小(0.1%)的遗传差异,主要是单核苷酸多态性(SNPs)。SNP是指基因水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性,其在群体中的频率不小于1%,包括单碱基转换、颠换、插入或缺失等变化。由于在人类基因组中,三、四等位基因(allele)形式的SNP非常罕见,因此SNP也简单指双等位基因,其两个不同等位基因的组合称为基因型(genotype)。人类基因组中存在数量巨大的SNPs,其中一些可能影响相应基因的表达、所编码蛋白的结构或功能,进而影响个体催患疾病的可能性、对药物的反应性以及不同患病个体的预后。SNP在基因序列中的高密度、代表性、遗传稳定性,以及检测的易实现等特点体现了新一代遗传标记的优越性,成为继第一代限制性片段长度多态性标记和第二代微卫星标记后的第三代基因遗传标记,并被迅速接受从而成为遗传研究领域中极为活跃的内容。根据其在基因中的位置,SNP可分为基因编码区SNP (Coding SNP, cSNP)和基因调控区SNP(Regulatory SNP, rSNP)。其中,cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP (Synonymous cSNP)和非同义cSNP (Non-synonymous cSNP)。同义cSNP指碱基序列的改变并不影响蛋白质的氨基酸序列,而非同义cSNP可改变编码的氨基酸残基的种类,从而使蛋白质的结构和功能发生变化。此外,出现在调控区的rSNP则可以通过影响与转录因子或miRNA的结合,引起基因表达水平的改变或mRNA的稳定性及翻译过程的变化,进而影响细胞正常功能。因此,这些潜在功能性SNPs通常被优先选择用于探讨与疾病发生发展及预后的关系,从而为包括肺癌在内的恶性肿瘤的防制及临床治疗决策提供科学依据。研究己发现,细胞周期紊乱是肿瘤发生最主要的机制,细胞恶性化的核心事件是正常的细胞周期进程被破坏使肿瘤细胞顺利进入细胞周期进程,相关调控蛋白和信号转导通路发生改变,失去分化能力,从而发生恶性增殖。除细胞周期调控因子外,趋化因子是另一类与肿瘤发生发展密切相关的家族。趋化因子是一类与肿瘤发生发展密切相关的家族。趋化因子是一类分子量8-12 kD、至少有2个保守半肌氨酸(Cys)组成的分泌型单链蛋白质,能够激活和趋化白细胞,参与免疫调节和免疫病理反应。根据其N端Cys顺序,趋化因子可分为4类：CXC (α)、CC(β), C(γ)种和CX3C (δ)。趋化因子主要通过与其特定的G蛋白偶联受体结合,参与包括造血细胞的生成、白细胞的迁移与归巢、胚胎的发育等许多正常生命活动,同时也参与包括炎性疾病、病毒感染、移植排斥、恶性肿瘤等众多病理过程。在肿瘤的发生发展中,不同的趋化因子起着不同的作用：一部分趋化因子能促进肿瘤的增殖,促进血管形成,诱导肿瘤细胞移动和粘附内皮细胞,加速肿瘤的扩散和转移；一部分趋化因子能抑制肿瘤细胞生长和血管形成,激发机体特异性和非特异性免疫应答,从而抑制肿瘤的生长和转移。研究表明,多数肿瘤可分泌多种异常高水平的趋化因子,其表达谱的差异可决定肿瘤浸润白细胞的种类与浸润程度,并且肿瘤转移和炎症细胞浸润有着相似的形成过程,涉及到细胞滚动、黏附和跨内皮迁移等。此外,己有多个报道发现,CXC(a)和CC(p)等趋化因子的表达失调可影响包括肺癌在内的多种肿瘤的发生、进展及预后。例如,肺癌细胞系中存在CXCL12的表达升高,且CXCL12的表观沉默是NSCLC预后良好的独立预测因子,CCL22的高表达与肺癌的进展及复发风险显著相关,高CXCR4/CXCL12表达水平与肺癌疾病进展相关联,并提示较差的预后(12,25,42-44)。体外和体内的实验表明,在肿瘤微环境中,CXCR4/CXCL12相互作用可能促进局部肿瘤的生长,而CXCR4高表达的肿瘤细胞具有更大的侵袭性和转移潜力。趋化因子CXCL12即基质衍生因子(stromal cell-derived factor, SDF-1),在肿瘤的发生发展、淋巴细胞的发育成熟及归巢、调节免疫炎症反应、促进血管生成等方面发挥着重要的作用。目前已知CXCL12在多种恶性肿瘤患者体内高表达,如乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌及肺癌等。但在NSCLC患者中表达情况目前研究相对较少。2010年Imai等报道,CXCL12在肺癌细胞系中表达明显高于正常支气管上皮细胞；小细胞肺癌细胞株与NSCLC细胞相比其表达无明显差异；在NSCLC肿瘤组织中CXCL12表达明显高于支气管上皮正常组织,研究还发现NSCLC患者体内CXCL12表达与CXCR4和CXCR7表达相关性较低。另外有研究发现在女性、不吸烟、腺癌患者中CXCL12表达明显升高,结合EGFR与CXCL12的关系分析,发现伴有EGFR突变的肺腺癌患者中CXCL12表达明显较野生型患者高,但差异无统计学意义,由于试验中EGFR检测患者例数较少,CXCL12与EGFR具体表达相关性有待于进一步研究。针对NSCLC Ⅰ,Ⅱ期患者CXCL12表达情况与预后分析研究发现,CXCL12高表达组与低表达组患者预后总生存期无明显差异,而对于晚期NSCLC患者,CXCL12表达与患者预后总生存期关系的研究报道较少。有研究指出CXCL12表达高的肺腺癌患者预后较差,具体原因及机制目前未见明确报道,可能与CXCL12异常甲基化及其受体异常表达有关。有研究发现,CXCL12在不同性别间作用不同,可能与男性患者中CXCL12异常甲基化表达缺失明显高于女性有关,具体机制也有待于研究证实。在NSCLC的CXCL12高表达患者中,假设如果阻止CXCL12与其受体结合从而阻断其信号传导通路,是否可以抑制肿瘤细胞发生发展及转移呢?Phillips等通过对严重免疫缺陷小鼠使用CXCL12抗体来中和小鼠体内CXCL12水平,从而抑制了肿瘤转移,这一实验证明了这一想法的可行性。体外实验进一步证实可以使用siRNA或抗CXCL12抗体来抑制肺癌细胞增殖。目前为止,对于NSCLC特别是CXCL12高表达患者,通过抑制CXCL12而阻断其信号转导通路是否可以治疗肺癌,该通路阻断后对人体正常生理机能有无影响未发现有明确报道,有待于深入研究。在编码CXCL12的基因3’转录非翻译区存在第801位的鸟嘌呤(G)向腺嘌呤(A)突变的多态性(记为CXCL12-3'G801A, rs1801157),该基因位点的多态性与哮喘、HIV感染和移植排斥反应等的相关性已有报道。近年来,多项研究表明CXCL12-3'G801A基因多态性参与肿瘤形成、发展、浸润及转移的多个过程。而侵袭和转移又是导致恶性肿瘤治疗失败的主要原因。前期研究表明前列腺癌患者中趋化因子CXCL12801核苷酸GA+AA基因型明显高于正常健康人群,而且CXCL12 G801A基因型患者有更多的淋巴转移。但是在对于CXCL12-G801A基因多态性在非小细胞肺癌的影响方面的研究极少,目前全球范围内仅见2篇相关报道。综上所述,一系列证据表明,趋化因子家族中相关基因表达或功能的改变在包括NSCLC在内的肿瘤发生发展及预后中发挥重要作用。然而,迄今为止,有关上述基因的多态性与NSCLC的预后分析还较少,己发表的2篇文献也仅是关注少数基因少数位点并仅针对中亚及台湾人群的研究。上述研究对于腺癌EGFR突变与CXCL12-G801A的关系也未做研究,同时对于中国内陆地区,CXCL12-G801A基因多态性对于中国汉族人群非小细胞肺癌的影响未见报道,本研究的目的就是通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测非小细胞肺癌CXCL12-G801A基因型分布,并进一步探讨CXCL12-G801A基因多态性对我国汉族人群非小细胞肺癌易感性和疾病进展、预后的影响。研究方法：1.从我院2012年1月到2014年1月入院治疗的患者中选取408例病理确诊为非小细胞肺癌的患者,另外招募303个健康个体一起进行该项研究(表1)。非小细胞肺癌患者没有接受术前放疗或化疗。招募的303名健康志愿者均来自周边省、市的汉族居民,并且与入组非小细胞肺癌患者之间没有任何血缘关系。收集非小细胞肺癌组与健康组患者年龄、性别及吸烟史。研究计划获上述参与单位伦理委员会批准,所以受试者均知情并同意参与。2.分别抽取空腹外周血5ml,采用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取两组研究对象的基因组DNA,采用PCR-RFLP分析方法和PIRA-PCR方法检测CXCL12-G801A的三种基本基因型(G/G,A/A和A/G)频率分布。3.采用SPSS1 8.0统计软件分析,所有数据均以均数±标准差(mean±SD,x±S)表示。两样本均数的比较采用t检验；组间等位基因型或等位基因的比较采用χ2检验。P0.05为统计学上有显著性差异。结果：1.CXCL12-G801A基因型判断突变的等位基因A经MspI酶切反应后,G/G纯合子被切为202及100 bp两条带,而A/A纯合子仍为302 bp,A/G杂合子则显示为302,202及100 bp 3条带(图1)2.病例组和健康对照组的一般资料非小细胞肺癌患者组与健康对照组间的性别构成无显著性差异(χ23.384,P=0.066)。3.两组患者的年龄情况病例组和对照组平均年龄分别是61.31±10.02岁和62.50±9.86岁。两组相比无统计学意义(P=0.115)。非小细胞肺癌患者组与健康对照组间的年龄构成无显著性差异。4. CXCL12-G801A SNPs与非小细胞肺癌发病风险的分析病例组和对照组CXCL12-G801A G/G基因型的频率分别是59.56%和66.37%。病例组和对照组CXCL12-G801A A/A基因型的频率分别为10.29%和7.92%。病例组和对照组CXCL12-G801A A/G杂合的频率分别为30.15%和25.74%。病例组和对照组CXCL12-G801A三种基因型比较差异无统计学意义(χ2=3.527,P=0.171)。5. CXCL12-G801A等位基因分布与非小细胞肺癌易感性的关系CXCL12-G801A基因型及等位基因在健康对照组(χ2=0.880,P=0.644)及NSCLC组(χ2=0.835,P=0.659)的分布均处于Hardy-Weinberg平衡,NSCLC组CXCL12-G801A多态性等位基因G及A频率分别是74.63%、79.21和25.37%、20.79%, CXCL12-G801A多态性等位基因G及A频率与健康对照组比较差异无统计学意义(χ2=2.495,P=0.114)。6.通过病例组和对照组的研究,我们也没有观察到与CXCL12-G801A多态性显著关联的临床参数和流行的基因型。7.根据病理分型和肺癌分期分析CXCL12-G801A的三种基本基因型(G/G, A/A,A/G)分布无统计学意义(x2= 1.349, P=0.509; x2= 12.141, P=0.059)。 CXCL12-G801A基因多态性与非小细胞肺癌的病理分型和肺癌分期无相关性。8、CXCL12-G801A的三种基本基因型(G/G, A/A, A/G)与肺腺癌的EGFR突变无相关性(χ2=1.196,P=0.550)。9、非小细胞肺癌中,CXCL12-G801A的三种基本基因型(G/G, A/A,A/G)1年生存率分别为G/G组33.75%、G/A组32.52%,A/A组33.33%,三种基因型1年生存率比较无统计学意义(χ2=3.096,P=0.213)。结论：1. CXCL12-G801A的三种基本基因型(G/G, A/A, A/G)分布与中国汉族人群非小细胞肺癌的发病率无相关性。CXCL12-G801A基因多态性和中国汉族人群非小细胞肺癌发病风险无关。CXCL12-G801A基因多态性不是中国汉族人群非小细胞肺癌的危险因素。2. CXCL12-G801A多态性等位基因A和G的分布与中国汉族人群非小细胞肺癌的发病率无相关性。CXCL12-G801A多态性等位基因A和G的分布不是中国汉族人群非小细胞肺癌的危险因素。3. CXCL12-G801A的三种基本基因型(G/G,A/A,A/G)与中国汉族人群非小细胞肺癌的病理分型和肺癌分期无相关性。4. CXCL12-G801A的三种基本基因型(G/G,A/A,A/G)与中国汉族人群肺腺癌的EGFR突变无相关性。5. CXCL12-G801A的三种基本基因型(G/G, A/A, A/G)与非小细胞肺癌1年生存率无相关性。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【图文】：

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本文编号：2794571