RACK1与食管鳞癌化疗耐药和放射抵抗的关系及相关机制探讨

发布时间：2020-08-15 14:14

【摘要】：第一部分RACK1与食管鳞状细胞癌化疗耐药的关系及相关机制的初步探讨背景食管癌是全球最常见和最难治的恶性肿瘤之一。食管恶性肿瘤组织学类型以上皮来源的最为多见,常见病理类型为腺癌和鳞癌两种,其中以鳞癌更为常见。我国食管癌中鳞癌占90%以上,腺癌占7%,其他病理类型少见。近几十年来,随着外科手术技术的逐步提高,新辅助治疗手段的日益改进,靶向药物的不断研发,免疫治疗的临床转化,食管癌总体治疗疗效水平有了显著的改善。大多数的食管癌患者确诊时处于进展期或者晚期,只能接受化疗、放疗、免疫治疗、辅助治疗等。只有对化学治疗药物敏感的患者才能从化疗中获益,而化疗耐药的发生严重影响了治疗疗效。所以,寻找影响食管癌化疗药物敏感度的指标及其在化疗耐药中的潜在机制势在必行。1989年,RACK1首次从鸡基因组DNA集群和人类B淋巴母细胞系cDNA文库中克隆出,它与G蛋白的β亚基具有高度的同源性。RACK1是色氨酸-天冬氨酸重复蛋白家族中的一员,采用了高度保守的七层折叠的β螺旋桨结构。作为锚定蛋白,RACK1可以与多种蛋白激酶或膜结合受体结合,运输结合蛋白,调节结合蛋白的活性,参与转录翻译的过程。RACK1基因在细胞生长、分裂、分化等多种生理活动和细胞侵袭、转移等病理过程中均扮演着不可或缺的角色。研究表明,在非小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞肝癌、结直肠癌等多种癌症中,与周围正常组织相比,RACK1呈现了差异性表达。我们之前的研究证实,RACK1与食管鳞癌的预后相关,并能促进肿瘤的进展和上皮间质转化的发生。研究表明,RACK1可以调节部分凋亡相关基因和药物敏感性相关基因,并与肿瘤的化疗敏感性相关。另外,近期研究发现,肿瘤中RACK1的表达水平与肝细胞肝癌的化疗耐药有一定的关系。研究目的本项研究旨在探讨RACK1基因对Eca109、EC9706等食管鳞癌细胞系的克隆能力、增殖能力、凋亡能力及化疗药物作用的敏感性的影响,并进一步探究RACK1与食管鳞癌化疗耐药之间的潜在作用机制,为改善食管癌化疗耐药提供新的方向和思路。研究方法1.细胞培养及转染:在37℃恒温、稳定C02水平(含5%)的培养箱内培养Eca109和EC9706,每隔2-3天进行传代培养。将载有shRNA或者shNC或者靶向RACK1基因开放阅读框的质粒用脂质体2000溶剂分别转染至Eca109和EC9706细胞中。敲减或过表达的细胞需继续培养48-72h,确定转染效率并进行后续实验。2.筛选稳定转染株:确定Eca109和EC9706细胞适宜的G418筛选浓度。使用G418药物浓度为400ug/ml(筛选浓度)的培养液培养转染细胞14天,后续使用G418药物浓度为300ug/ml(维持浓度)的培养液维持培养,筛选出稳定转染的细胞株。3.检测转染效率:转染后的食管鳞癌细胞中RACK1表达水平通过实时PCR和免疫印迹实验在RNA和蛋白质两个层次上进行检测,证实Eca109和EC9706中RACK1过表达或敲减的效率。4.克隆形成实验:培养瓶中的细胞被胰蛋白酶溶液消化成单细胞悬液,吹打均匀,每孔加入2ml细胞悬液,按照250个/ml的密度将细胞种板至六孔板内。在37℃恒温、5%C02的培养箱内进行14天的培养后,加入无水乙醇固定10分钟,后用浓度为0.1%的结晶紫染料染色30分钟。计算形成克隆数,包含50个细胞及以上的细胞集团可视为一个克隆。克隆形成率指的是转染细胞(敲减或过表达RACK1基因)形成的克隆数除以对照组细胞(未转染)形成的克隆数。5.化疗耐药实验:将转染细胞和对照细胞按照1X 104个/孔密度种板至96孔板内,待细胞平铺均匀,每孔加入不同浓度的顺铂(1-320umol/L)和5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)培养48至72小时。CCK8实验用来检测细胞的活性。将细胞稀释至5×104个/ml,均匀种板至六孔板中,恒温培养箱内培养24h,加入化疗药物顺铂(1-320umol/L)或5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)。细胞继续培养24、48、72小时后,用以分别检测RACK1基因转录和翻译的水平。6.细胞增殖和毒性实验(CCK8实验):将转染过shRACK1质粒、shNC质粒和过表达质粒的细胞种板至96孔板中。待细胞于恒温培养箱内培养24h贴壁后,分别给予不同浓度的顺铂(1-320umol/L)或5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)培养48h或72h。每个孔内加入10ul CCK8溶液,培养箱内培养1-4h,每间隔1h使用酶标仪检测450nm波长处的光谱吸光度。根据0D值计算细胞活性。7.流氏细胞学分析:收集待检测的食管癌细胞,用PBS溶液冲洗。室温下加入PE和7ADD染色缓冲液维持15min。使用FACSAriaⅡ仪器检测细胞凋亡率,数据处理使用Flowjo软件进行。研究结果1.转染食管鳞癌细胞系,上调或下调mRNA和蛋白质表达水平:为了探讨不同RACK1表达水平在食管鳞癌中发挥的作用,我们构建了转染细胞系:将携带shRACK1、shNC、RACK10RF的质粒转染至Eca109、EC9706细胞中并筛选稳定表达株。实时定量PCR法分别用于检测转染过表达、对照、shNC、shRACK1的Eca109、EC9706细胞中RACK1的mRNA水平。与对照组相比,过表达Eca109细胞中RACK1的mRNA水平上升至6.76±1.46(P=0.0209),过表达EC9706细胞中RACK1的mRNA水平上升至7.76±0.31(P=0.0007)。此外,转染了 shRACK1的Eca109细胞中RACK1 的 mRNA 水平为 0.44±0.06(P=0.0037),转染了 shRACK1 的 EC9706 细胞中RACK1的mRNA水平为0.33±0.07(P=0.0041)。RACK1的蛋白表达水平通过WB实验检测。在Eca109和EC9706过表达组,RACK1的蛋白表达水平明显提高。与未转染组相比,RACK1敲减组的蛋白水平显著下降。2.上调或下调RACK1影响细胞的克隆形成能力:克隆形成实验的结果表明,通过转染shRACK1敲减RACK1基因后,细胞的克隆能力显著下降(Eca109:254±11 vs 343±15,P=0.0013;EC9706:187±23 vs 353±7,P=0.0003,Figure 2a and b)。过表达RACK1组的克隆形成能力有了显著提升(Eca109:393±14vs 343±15,P=0.0148;EC9706:369±12 vs 353±7,P=0.0280)。3.化疗药物作用下,RACK1增强Eca109和EC9706的增殖能力:CCK-8实验结果显示:当不同浓度的顺铂(0-320μM)和5-氟尿嘧啶(Eca109,0-10μM,EC9706,0-320μM)作用于 Eca109 和 EC9706 细胞 48h 或 72h 时,RACK1 过表达组的食管鳞癌细胞的增殖能力明显提高(P0.001),而RACK1敲减组食管鳞癌细胞的增殖能力明显降低(P0.001)。4.RACK1调节食管癌化疗耐药:上调RACK1可以显著抑制顺铂药物诱导的细胞凋亡的发生,下调RACK1可以促进细胞对顺铂药物作用的敏感性(Eca109:P0.001 for shRACK1,P0.01 for shNC and P0.001 for over group;EC9706:P0.001 for shRACK1,P0.001 for shNC and P0.05 for over,respectively)。同样地,5-氟尿嘧啶作用的细胞也出现类似的结果(Eca109:P0.001 for shRACK1,P0.01 for shNC,P0.05 for over;EC9706:P0.001 for shRACK1,P0.001 for shNC,P0.05 for over)。这些数据显示 RACK1在调节食管癌细胞对化疗药物的治疗疗效方面扮演重要角色。5.RACK1导致食管癌细胞发生化疗耐药的有关机制研究:为了探究RACK1影响食管鳞癌细胞对化疗药物敏感性不同的机制,我们检测了敲减或过表达RACK1基因后细胞内相关的因子AKT、Erk1/2、Bcl-2和Bim的变化。我们的研究结果显示,AKT的磷酸化水平、抗凋亡蛋白Bc1-2的表达和促凋亡蛋白Bim的表达水平发生了显著的变化。我们检测了化疗药物对AKT、pAKT、ERK1/2、Bcl-2和Bim的影响。下调RACK1显著抑制了 AKT和ERK1/2的活性,降低了 Bcl-2的表达,促进了 Bim蛋白的表达。相反地,上调RACK1促进AKT和ERK1/2的激活,促进了 Bcl-2的表达,抑制了 Bim蛋白的表达。经过24、48、72h的化疗药物作用之后,我们观察到转染了 shRACK1的细胞中pAKT和Bcl-2的表达明显降低,而Bim蛋白的表达随着顺铂和5-氟尿嘧啶药物作用时间的延长而逐步升高。结论RACK1可以激活PI3K/AKT通路,促进AKT磷酸化的发生,并上调Bcl-2的表达水平,降低Bim的表达水平,继而诱导食管癌细胞化疗耐药的发生。降低RACK1的表达,可以很大程度地增强食管癌的化疗敏感性。第二部分RAGK1与食管鳞状细胞癌放射敏感性的关系研究背景食管癌是世界上发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤。根据最新流行病学调查研究显示,中国食管癌的年发病人数可达477900,年死亡人数约为375000。在亚洲,最常见食管癌组织学类型为鳞状细胞癌,而放射治疗是其非常重要的治疗方式之一。然而,由于肿瘤容易发生局部复发和远处转移,放射抵抗成为导致放疗失败的重要因素。因此寻找新的影响放射敏感性的指标并研发有效的放射增敏剂以改善放射治疗策略,成为当前一个亟待解决的问题。活化的蛋白激酶C受体1(RACK1)是一种活化的蛋白激酶C的结合蛋白质。作为色氨酸-天冬氨酸蛋白家族中的一员,RACK1可以与多种蛋白质结合并且参与许多信号转导通路的过程,例如PKC,JNK,Src,NF-kB等等。另外,RACK1在多种肿瘤的进展、复发、转移等过程中均发挥着不可替代的重要作用。我们前期研究表明RACK1与食管鳞癌的不良预后和肿瘤细胞的上皮间质转化相关。目前,尚未发现关于RACK1和放射治疗敏感性方面的报道。Bergami等人发现在黑色素瘤中,上调RACK1的表达能够减少紫外线诱导的细胞凋亡,导致辐射抵抗的发生。同时,调节RACK1表达水平能够改善黑色素瘤对放射治疗的敏感性。RACK1与放射抵抗间可能存在着一定的联系,但目前RACK1在放疗领域的研究仍是空白。研究目的在本项课题中,我们旨在探讨RACK1表达水平与食管鳞状细胞癌细胞放射敏感性之间的关系,并对可能参与的通路、分子进行初步的机制研究。研究方法1.细胞培养:将Ecal09和EC9706细胞在补充有10%胎牛血清,100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640培养基中培养,每2-3天传代。2.细胞转染:用脂质体2000溶剂将载有shRNA或者shNC或者靶向RACK1基因开放阅读框的质粒分别转染至Ecal09和EC9706细胞中。用400 ug/mL的G418培养液连续培养14天,并用300 ug/mL的G418培养液维持培养,筛选出稳定转染的Ecal09和EC9706细胞株。RACK1的表达水平均通过实时PCR和免疫印迹实验进行检测,证实Ecal09和EC9706中RACK1过表达或敲减的效率。3.克隆形成实验:将细胞消化成单细胞悬浮液,并将其按照每孔约500个细胞接种至六孔板中。24h后待细胞贴壁,使用varian23EX医学直线加速器照射实验组与对照组细胞,单次照射剂量分别为0、2、4、6、8Gy。培养14天后,将细胞固定在无水乙醇中,用结晶紫染色半小时,并计数形成的细胞集落(细胞数大于等于50个)。附着率是指培养结束后某孔形成的细胞集落数量与该孔种植的细胞数量之比。存活分数(Survival fraction,SF)是指每个剂量的附着率除以OGy的附着率。集落形成能力是指在相同照射剂量下,实验组SF与对照组SF的比例。4.细胞增殖和毒性实验(CCK8实验):将实验组和对照组细胞分别种板至96孔板中并培养24小时。用单次剂量分别为0、2、4、6、8Gy射线处理转染组和对照组细胞并培养48小时。每孔加入10ul CCK8试剂和100ul培养基,然后孵育1小时。用自动酶标仪(BioRad)检测450nm处细胞的光谱吸光度。根据0D值计算细胞活性,活细胞百分比=(0D转染组-0D空白组)/(0D控制组-0D空白组)*100。5.流氏细胞学分析:将Ecal09和EC9706接种到6孔板中,24h后给予单剂量4Gy射线照射。细胞培养24小时后,收集细胞并将细胞与PE/7-ADD染色缓冲液在室温下孵育15分钟。使用BDFACSCalibur仪器检测细胞凋亡。数据分析由Flowjo软件进行。PE膜联蛋白V和7-AAD阴性细胞被认为是存活的;PE膜联蛋白V阳性和7-AAD阴性细胞作为早期凋亡细胞;PE膜联蛋白V和7-AAD均阳性细胞对应于晚期凋亡或已经死亡的细胞。6.统计学分析:使用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据表示为平均值土标准误差,使用双尾Student’s t检验和Oneway AN0VA进行各组间学比较。使用GraphPad Prism 5.01版软件,将多靶单击模型拟合成剂量存活曲线。所有数据均重复了至少三次独立实验。P值0.05(*)或0.01(**)被认为有统计学差异。研究结果1.转染食管癌细胞系,敲减或者过表达RACK1基因:我们分别使用RT-PCR和Western Blot来检测转染细胞中RACK1在mRNA和蛋白质水平的表达。同shNC对照组相比,过表达RACK1的Ecal09细胞中RACK1的mRNA水平上升至3.76±0.31倍(P=0.0002),过表达RACK1的EC9706细胞中RACK1的mRNA水平上升至5.43±0.30倍(P0.0001);敲减RACK1的Ecal09细胞中RACK1的mRNA水平下调至0.44土0.06(P=0.0032),敲减RACK1的EC9706细胞中RACK1的mRNA水平下调至0.33±0.07(P=0.0056)。2.下调RACK1降低了照射后细胞的克隆形成能力,相反,上调RACK1促进了照射后细胞的克隆形成能力:随着单次照射剂量逐渐升高,同一细胞形成的克隆数逐渐减少。另外,在同等剂量作用下(2 Gy、4 Gy、6 Gy、8Gy),shRACKl组形成的克隆数明显少于shNC组,过表达RACK1组的克隆数较shNC组升高。在Ecal09和EC9706两种细胞系中得到了类似的结果。结果显示下调RACK1可以降低放射线照射后的细胞克隆能力,而上调RACK1可以促进照射后的细胞克隆能力。3.为了检测放疗对细胞的存活能力的影响,我们构建了多靶点单击模型,进而拟合了剂量存活曲线。SF(存活分数)=1-(l-e-kD)n。SER(增敏比)=(shNC组Dq)/(shRACKl或over-RACKl组Dq)。我们计算了放射敏感性相关的参数k,n,DD,Dq,D37,SF和SER。我们发现敲减RACK1可以提高Ecal09和EC9706细胞的SER,而过表达RACK1降低了ESCC细胞的SER。4.敲低RACK1减少ESCC细胞在放射作用下的增殖能力;而过表达RACK1可以促进射线作用下的细胞增殖能力:使用单次剂量为OGy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的射线分别照射食管癌细胞并培养48h。CCK-8实验的生存曲线结果显示:在单次为2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的射线作用下,过表达RACK1组的存活细胞比例明显高于对照组,敲减RACK1组的细胞存活率低于对照组(P0.001)。实验结果表示RACK1可以促进ESCC细胞的放射抵抗性,RACK1过表达可以降低ESCC对放射线作用的敏感性。5.RACK1过表达可以减少凋亡细胞的数量,促进ESCC细胞对放射治疗的抵抗性:我们进行PE Annexin-V 7-AAD检测,对4Gy射线预处理和48小时孵育的ESCC细胞进行了流式细胞术分析。单次4Gy照射后,过表达RACK1组的凋亡细胞百分比相对于对照组而言显著降低(Ecal09:过表达组23.49%±1.56%vs对照组31.08%±1.23%,P=0.0187;EC9706:过表达组17.21%±1.15%vs对照组26.14%±1.59%,P=0.0105)。与对照细胞相比,敲减RACK1显著增加了ESCC细胞中放射相关的细胞凋亡率(Eca109:shRACK1组42.35%±1.04%vs对照组31.08%±1.23%,P=0.0022;EC9706:shRACKl组42.64%±2.91%vs对照组26.14%±1.59%,P=0.0076)。这些数据表明,RACK1对ESCC在放射线作用下的凋亡能力起调节作用。6.敲减RACK1抑制了pAKT和Bcl-2的表达,促进Bim的表达:我们通过免疫印迹实验检测了单次剂量4Gy照射下,细胞凋亡相关蛋白的表达水平。与对照组相比,下调RACK1可以减弱AKT磷酸化水平,降低pAKT和Bcl-2的表达,同时Bim表达提高。相反地,过表达RACK1激活了AKT的活性,促进pAKT的表达,上调Bcl-2水平,降低了Bim水平。Ecal09和EC9706两种细胞系均表现了类似的结果。结论RACK1与食管癌放射敏感性之间有着密切的联系,高表达RACK1可以促进肿瘤放射抵抗的发生,而敲减RACK1则会提高肿瘤细胞对放射线作用的敏感性。RACK1可以激活PI3K/AKT通路,促进AKT磷酸化的发生,上调Bcl-2的表达,下调Bim的表达。总之,本研究首次将RACK1与食管癌放射治疗疗效联系起来,并对其作用机制进行了研究,为改善食管癌放射敏感性提供了新方向。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1
【图文】：

细胞,普通显微镜,荧光显微镜,荧光显示

图１邋Ｅｃａｌ０９和ＥＣ９７０６细胞及细胞转染后荧光显示逡逑（ａ）普通显微镜下观察到的Ｅｃａｌ０９细胞（ｂ）荧光显微镜下观察到的转染后逡逑Ｅｃａｌ０９细胞（ｃ）普通显微镜下观察到的ＥＣ９７０６细胞（ｄ）荧光显微镜下观察到逡逑的转染后ＥＣ９７０６细胞逡逑

基因,过表达,转染效率,癌细胞系

图２食管淲癌细胞系Ｅｃａｌ０９和ＥＣ９７０６中ＲＡＣＫ１基因敲减或过表达逡逑（ａ）通过免疫印迹实验验证ＲＡＣＫ１基因在Ｅｃａｌ０９和ＫＣ９７０６细胞中的转染效率。逡逑与对照组相比，过表达组ＲＡＣＫ１基因的表达水平明显升高，而敲减组ＲＡＣＫ１基因逡逑的表达水平明显降低。内参基因自－ａｃｔｉｎ作为参照条带进行对照。（ｂ）邋Ｅｃａｌ０９逡逑

克隆形成,细胞,过表达,食管鳞癌

图３邋ＲＡＣＫｌ表达水平可以影响食管鳞癌细胞的克隆形成能力逡逑（ａ）上层３个图分别是过表达ＲＡＣＫ１的Ｅｃａｌ０９细胞、正常Ｅｃａｌ０９细胞、敲减ＲＡＣＫ１逡逑的Ｅｃａｌ０９细胞的克隆形成能力的结果。下层３个图分别是过表达ＲＡＣＫ１的ＥＣ９７０６逡逑细胞、正常ＥＣ９７０６细胞、敲减ＲＡＣＫ１的ＥＣ９７０６细胞的克隆形成能力的结果。（ｂ）逡逑

【参考文献】