MiR-30a靶向LRP6调控口腔鳞状细胞癌细胞增殖

发布时间：2020-08-17 14:08

【摘要】：目的:课题组前期研究发现miR-30a是靶向LRP6的潜在miRNA。为了进一步研究miR-30a靶向LRP6对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响及作用机制,本研究在口腔鳞状细胞癌细胞系水平上探讨miR-30a表达与LRP6表达的相关性;以HSC-3、Cal-27细胞为研究对象,检测miR-30a靶向抑制LRP6对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响;本研究将可能发现miR-30a/LRP6信号作为新的口腔鳞状细胞癌致病机制,并为口腔鳞状细胞癌及其他恶性肿瘤的诊断治疗提供新思路和新靶标。方法:(1)分别应用Western blot和QPCR检测6株口腔鳞状细胞癌细胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9和正常口腔鳞状细胞HOK中LRP6和miR-30a的表达,利用Pearson法分析miR-30a与LRP6表达的相关性;(2)TragetScan在线生物信息学数据库预测miR-30a与LRP6靶向调控关系;双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a与LRP6靶向作用;HSC-3和Cal-27细胞中过表达miR-30a分别利用Western blot和QPCR检测LRP6蛋白和mRNA表达变化;(3)构建过表达LRP6的pcDNA3.1-LRP6质粒,转染HSC-3和Cal-27细胞,建立过表达LRP6细胞株;MTT和克隆形成实验分别检测过表达miR-30a及miR-30a联合外源过表达LRP6对HSC-3和Cal-27细胞增殖和克隆形成能力影响;(4)转染siLRP6构建沉默LRP6的HSC-3和Cal-27细胞,MTT和克隆形成实验分别检测沉默LRP6对HSC-3和Cal-27细胞增殖和克隆形成能力影响;(5)Western blot检测沉默LRP6、过表达miR-30a及过表达miR-30a联合外源表达LRP6后LRP6及其下游Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin、Cyclin D1、FGF8表达变化。结果:(1)Western blot检测发现LRP6在正常口腔鳞状细胞HOK中低表达,在6株口腔鳞状细胞癌细胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9中相对高表达,QPCR检测发现miR-30a在正常口腔鳞状细胞HOK中高表达,在6株口腔鳞状细胞癌细胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9中普遍低表达,两者表达水平呈显著的负相关;(2)在线数据库TargetScan发现LRP6是miR-30a的潜在靶标,LRP6的3’UTR中含有与miR-30a互补结合的核苷酸位点;双荧光素酶报告基因实验发现,转染miR-30a后pmirGLO-LRP6-3'UTR-WT组荧光素酶活性显著下降,而将LRP6的3'UTR中miR-30a结合位点突变后,其荧光素酶活性无显著变化;HSC-3、Cal-27细胞中转染miR-30a后LRP6 mRNA和蛋白表达均显著下调,证实在口腔鳞状细胞癌细胞中LRP6确实是miR-30a的靶标;(3)HSC-3、Cal-27细胞过表达miR-30a显著地抑制细胞增殖和克隆形成能力;过表达miR-30a联合外源表达LRP6后细胞增殖和克隆形成能力部分恢复;(4)HSC-3、Cal-27细胞沉默LRP6后细胞增殖能力和克隆形成能力均被显著抑制,得到与过表达miR-30a一致变化;(5)在HSC-3细胞中,miR-30a能够靶向抑制LRP6及其下游Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Cyclin D1、FGF8的表达。结论:miR-30a能够靶向抑制LRP6及其下游Wnt/β-catenin信号转导来发挥抑制口腔鳞状细胞癌的作用,揭示口腔鳞状细胞癌发生进展潜在新机制,为其临床诊断和治疗提供了新思路和新靶标。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.8
【图文】：

口腔鳞状细胞癌,细胞系,鳞状细胞,口腔

P6 异常高表达与多种人类癌症类型的发生发口腔鳞状细胞癌[23-25]。本课题利用 Western bl HSC-4、HSC-3、Cal- 27、Um1、Um2、SCCRP6 表达，结果发现LRP6 正常口腔鳞状细胞细胞癌细胞系中高表达（图 1.1）。LRP6 在 HS高，在 HSC-4、Um1、Um2 和 SCC9 细胞系 Cal-27 细胞系作为后续实验研究细胞模型。miR-30a 作为一个抑癌因子在多种恶性肿瘤中[35, 36]、肾癌[39]及口腔鳞状细胞癌[33]等。本课题癌细胞系 HSC-4、HSC-3、Cal- 27、Um1、系 HOK 中 miR-30a 表达，结果发现 miR-30a 达，在 6 株口腔鳞状细胞癌细胞系中普遍低表达呈显著负相关（图 1.3）。

鳞状细胞,口腔鳞状细胞癌,表达水平,细胞系

腔鳞状细胞系 HOK 和 6 株口腔鳞状细胞癌细表达水平；与 HOK 相比，P< 0.05 Relative miR-30a expression levels (normalizedCR in normal oral squamous cell line HOK and cell lines; compared with HOK, P<0.05

口腔鳞状细胞癌,细胞株,负相关,鳞状细胞癌

26腔鳞状细胞癌细胞株中 miR-30a 与 LRP6 表达呈显3 The expression of miR-30a was inversely correlated protein expression in OSCC cell lines.细胞癌细胞中 LRP6 是 miR-30a 的靶标鳞状细胞癌中是否由于 miR-30a 异常表达进而导线数据库 TargetScan 发现 LRP6 是 miR-30a 的潜在 miR-30a 互补结合的核苷酸位点（图 2.1）。为了进一构建了 pmirGLO-LRP6-3'UTR-WT/Mut 质粒，经双

【参考文献】