基于高分子与穿膜肽修饰的纳米材料的制备及对黑色素瘤细胞诱导凋亡研究

发布时间：2020-08-18 17:41

【摘要】：恶性黑色素瘤作为一种最常见的皮肤癌症之一,一直是人类不断试图攻克的疑难。现今,对黑色素瘤的治疗仅限于传统的治疗手段,包括免疫治疗,化学治疗,手术等。研究者正在寻找一种更有效和更低毒副作用的治疗手段,以待取代传统的手段。目前,科学家开始使用基因治疗这种新型的治疗方式,用于很多疾病的治疗,尤其是非病毒载体介导的基因治疗技术正在被深入研究。本论文的出发点即为制备出具有良好生物相容性和高转染效率的非病毒类纳米载体,并将其应用于黑色素瘤的凋亡基因转染和诱导凋亡的研究。主要内容如下：以具有良好生物相容性的聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)和壳聚糖(chitosan,CS)为基础,分别评价了聚乙烯亚胺与壳聚糖／三聚磷酸钠(sodiumtripolyphosphate, TPP)两种纳米载体的细胞转染效率和生物相容性等指标,发现两者作为A375细胞(人类恶性黑色素瘤细胞)的转染载体均不太理想。最终,借助细胞穿膜肽(trans-activating transcriptional activator, TAT),我们制备出了具有较高转染效率和低细胞毒性的非病毒类纳米复合物载体PEI-SMCC-TAT (polyethyleneimine-sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate-TAT, PST),同时结合P53正向凋亡调节因子基因(p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA),评价了新型纳米载体PST转染凋亡基因并诱导黑色素瘤细胞进入凋亡程序的效果,初步评价了这种治疗黑色素瘤方法的可行性,也从一定程度上为基于高分子的非病毒纳米载体用于基因治疗黑色素瘤的后续研究奠定了基础。生物相容性分析结果显示,PEI/DNA复合物的细胞毒性强于PST/DNA复合物给细胞带来的毒性。而CS/TPP-DNA复合物的生物相容性最好。粒度分析结果显示,在N/P比从4到50的范围内,PEI/DNA复合物的粒径尺寸均稳定在170 nm左右。CS/TPP-DNA纳米载体系统则具有较大的粒径。在不同体积比条件下,其粒径均在350 nm左右。这也是壳聚糖作为载体只具有低细胞转染效率的重要因素之一。在N/P达到50时,PST/DNA则呈现出200 nm以下的粒径大小。凝胶阻滞分析结果显示,PEI、CS/TPP、PST均具有良好的核酸阻滞能力。傅里叶变换红外光谱则显示PEI聚合物骨架已成功通过交联剂SMCC修饰上TAT穿膜肽。此外,本论文还通过离子凝胶法制备了CS/TPP纳米粒子,讨论了pH值、体积比等因素对其粒子形貌和粒径的影响。采用粒度分析、生物相容性分析、凝胶阻滞分析等研究了其作为纳米载体的特性,结果表明其对HEK293T细胞与A375细胞只具有较低的转染效率。本论文最终合成了在A375细胞中具有增强的转染效率的PST纳米载体,系统地考察了不同合成因素对新型纳米载体PST组成和转染效率的影响,如TAT与Sulfo-SMCC的加入量和PST的N/P(大于20)对其转染效率的影响等。最后,将最佳条件合成的PST纳米载体携带PUMA凋亡基因,通过双染Annexin-FITC/DAPI和Annexin-APC/7-AAD,进行流式细胞仪的凋亡分析和细胞膜细胞核染色情况分析,考察PUMA诱导的黑色素瘤细胞的凋亡情况。综述所述,本论文分别考察了PEI, CS/TPP作为纳米载体的转染能力,并进一步制备了具有高转染效率的新型纳米载体PST。通过各类表征测试,制备出了具备良好生物相容性、较高转染效率的高分子纳米载体PST。最终,将PST携带凋亡基因PUMA对黑色素瘤细胞进行凋亡诱导,探讨将其应于基因治疗的潜在价值,为后续的黑色素瘤基因治疗研究提供新的途径。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5;R450

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本文编号：2796532