中国地鼠口腔黏膜癌中microRNA差异表达谱建立及其调控网络研究

发布时间：2020-08-19 09:28

【摘要】：目的:利用高通量第二代测序技术(nest generation sequencing,NGS)对中国地鼠口腔黏膜癌microRNA进行测序,应用生物信息学技术方法分析,构建miRNA差异表达谱,预测其靶基因,进一步筛选出口腔黏膜癌分子标志物,探讨miRNA在口腔黏膜癌的发生、侵袭、转移及预后中的调控机制,从比较医学的角度为口腔黏膜癌的预防和治疗提供理论依据。方法:利用二甲基苯并蒽(9,10-Dimethy1-1,2-Benzanthracence,DMBA)涂抹法建立中国地鼠口腔黏膜癌模型;通过microRNA测序技术和生物信息分析构建中国地鼠口腔黏膜癌组织和正常组织的差异表达的miRNA表达谱,预测靶基因后进行GO富集分析和KEGG Pathway分析;用RT-qPCR技术验证部分显著差异表达的miRNA;用免疫组化和RT-qPCR测定miR-21调控下PTEN/PI3K/AKT通路中PTEN、p-AKT及相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的表达水平。结果:在成功构建中国地鼠口腔黏膜癌模型的基础上,对口腔黏膜癌组织和正常组织进行miRNA测序,共得到已知差异miRNA 268个,其中137个表达上调,131个表达下调;进一步分析获得显著差异的miRNA共有11个,其中上调的miRNA有8个(miR-542-3p、miR-130b-3p、miR-142-5p、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-21-3p、miR-21-5p),下调的有3个(miR-504、miR-499-5p、miR-486-3p);对显著差异表达的miRNA的靶基因预测并进行GO和KEGG Pathway分析后,得到与OSCC相关的生物学过程的GO条目有340条、与细胞组分相关的GO条目有47条以及与分子功能相关的GO条目有46条和15条显著富集通路,富集的GO条目主要在解剖结构形态、信号调控、细胞通讯调节、细胞突起、细胞骨架、神经元部分、阴离子配位、转移酶活性、ATP的结合等方面,极显著的KEGG通路(q0.01)是Notch信号通路、磷脂酰肌醇信号转导通路和慢性粒细胞白血病通路。预测得到208个新miRNA,其中有112个表达上调,96个表达下调;进一步深度分析,得到显著差异的miRNA共有3个(p0.05),其中上调的miRNA有1个,下调的有2个,同样进行生物信息学分析得到与细胞组分相关的1条GO条目。显著差异表达的miRNA利用RT-qPCR得到验证,验证结果与miRNA-Seq结果高度一致。PTEN/PI3K/AKT通路中PTEN表达下调、p-AKT表达上调;相关凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达下调、Bcl-2表达上调。结论:本研究利用miRNA-Seq技术对中国地鼠口腔黏膜癌组织和正常组织的miRNA测序,发现11个miRNA有显著差异,并预测出3个新的miRNA显著差异表达,从而导致Notch信号通路、磷脂酰肌醇信号转导通路和慢性粒细胞白血病通路等15条与口腔黏膜癌相关的信号通路的活化;其中miR-21的两个成熟变异体miR-21-3p和miR-21-5p的表达显著增高,其直接靶基因PTEN下调,影响PI3K/AKT通路的活化,进而影响相关凋亡蛋白的表达,从而导致口腔黏膜癌的发生发展,miR-21可以作为分子标志物指导OSCC临床实践。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.85
【图文】：

NomalTR141563 2375 106.9 1.5 1.8 1.2 7.1 BTR141565 1115 50.2 2.1 1.8 1.5 6.7 BCancerTR140679 3500 157.5 1.9 1.6 1.2 8 ATR140681 3940 177.3 1.7 1.7 1.7 9.6 ATR147836 3200 144 2 1.9 1.4 7.8 B注：A. 样品合格，符合建库要求；B. 一些指标切合测序要求，可试验建库。2.3 测序原始数据及小 RNA 序列长度分布2.3.1 miRNA 测序原始数据原始数据以 FASTQ 格式呈现，示例如下（见图 1-1）。其中，首行以@开始紧跟 Illumina 测序标识别符和描述文字；第二行呈现碱基序列；第三行以“+”开始紧接 Illumina 测序标识别符；第四行对应碱基测序质量。

.3.3 miRNA 测序数据过滤统计汇总将原始数据过滤之后统计，结果见表 1-3。从表中可以看出，Cancer 组测得始序列（Raw Reads）为 2.8~3.1×107，过滤后的干净序列（Clean Reads）为 2.2~2.4×1占总序列的 77%~81%，其中约有98%的Clean Reads 的碱基质量分数≥20，94%~98≥30，将相同序列合并之后得到的序列种数（Unique Clean Reads）为 1.0~1.4×10omal 组测得的 Raw Reads 为 2.8~3.0×107，过滤后的 Clean Reads 为 2.1~2.3×107占总序列的 74%~78%，其中约有 98%的 Clean Reads 的碱基质量分数≥20，94%30，将相同序列合并之后得到的 Unique Clean Reads 为 1.2~1.7×106。综上所述，究测序数据符合分析要求。图 1-2 数据过滤结果图注：横坐标表示样本，纵坐标表示百分比，不同颜色表示不同的过滤指标。图 1-3 百分比质控图注：横坐标表示样本，纵坐标表示百分比，不同颜色表示不同的统计指标。

.3.3 miRNA 测序数据过滤统计汇总将原始数据过滤之后统计，结果见表 1-3。从表中可以看出，Cancer 组测得始序列（Raw Reads）为 2.8~3.1×107，过滤后的干净序列（Clean Reads）为 2.2~2.4×1占总序列的 77%~81%，其中约有98%的Clean Reads 的碱基质量分数≥20，94%~98≥30，将相同序列合并之后得到的序列种数（Unique Clean Reads）为 1.0~1.4×10omal 组测得的 Raw Reads 为 2.8~3.0×107，过滤后的 Clean Reads 为 2.1~2.3×107占总序列的 74%~78%，其中约有 98%的 Clean Reads 的碱基质量分数≥20，94%30，将相同序列合并之后得到的 Unique Clean Reads 为 1.2~1.7×106。综上所述，究测序数据符合分析要求。图 1-2 数据过滤结果图注：横坐标表示样本，纵坐标表示百分比，不同颜色表示不同的过滤指标。图 1-3 百分比质控图注：横坐标表示样本，纵坐标表示百分比，不同颜色表示不同的统计指标。

【参考文献】

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本文编号：2796921